植物非编码RNA及其在甜菜中的应用研究

李任任，吕春华，於丽华 ，耿贵

（1.黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨150080；2.黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080）

0 引言

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）[1]指不具备编码蛋白质功能的RNA，包括微小RNA（miRNA）、小干扰RNA（siRNA）、小核RNA（snRNA）、小核仁RNA（snoRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circular RNA，circRNA）等[2]。这些RNA不翻译成蛋白而直接发挥催化和调控功能，在RNA水平上就能行使各自的生物学功能，在生物体的多种生理生化过程中发挥着重要作用。最近几十年，关于作物非编码RNA的研究已成为育种学家关注的热点问题，解析非编码RNA的调控原理，克隆相关性状并设计高产高效的新型抗性品种已成为解决粮食问题的一个新的方向。

甜菜（Beta vulgaris L.）属藜科多年生的温带作物，是世界上第二大糖料作物，世界上有30%的糖来源于甜菜[3]。甜菜广泛分布在我国的东北、西北和华北地区，其根部主要用来制糖，茎和叶可做动物饲料，具有较高的经济价值[4]。目前关于甜菜方面的研究主要集中在其生理和分子方面，关于甜菜非编码RNA方面的研究报道比较少，除了最近发现的可能影响甜菜春化机制的lncRNA外，大部分集中在miRNA参与甜菜抗逆方面，其他类型非编码RNA的研究几乎处于空白阶段。因此，对于研究者来说，发现和解析甜菜非编码RNA的产生方式、作用机理以及生物学功能等特征，对甜菜品种的遗传改良、产糖量和产糖率的提高、抗逆性的增强等具有重要的现实意义。

1 植物非编码RNA

1.1 miRNA

miRNA是在真核生物中分布广泛的一类单链小分子RNA，内生且不具备编码蛋白质功能。其长度为21～23个碱基，虽然体积很小，但是却是参与转录后调控的关键因子[5]，其能够在转录后水平对目标基因进行负调控。近些年其调控机制已经研究得较为清楚，大部分植物miRNA利用AGO1蛋白剪切靶mRNA上的磷酸二脂键，最终导致靶mRNA的降解[6]；还有一部分是借助于不完全配对来抑制靶mRNA的翻译，但多见于动物[7]。另外有报道发现miRNA还能够在转录水平上通过诱导靶标基因位点甲基化来沉默靶标基因的表达[8]。

第一次发现miRNA（lin-4、let-7）是在秀丽隐杆线虫中，这是首次在动物中发现miRNA[9]。而十几年后，才在拟南芥中发现植物的miRNA[10]，之后多种模式植物的miRNA陆续被发现，比如玉米、水稻、大豆等[11]。诸多证据表明，miRNA在转录及转录后水平上发挥着重要作用，特别是在植物的形态发育调节以及抗逆调节等方面，广泛参与植物的各种生命过程[12]。在拟南芥中已发现多种miRNA调控其形态的发育，如miR319（mir-JAW）基因能控制叶片形态，当其表达过量时，会导致叶片外缘锯齿化及偏上生长[13]。另外，miR156、miR165和miR166等除了在模式植物拟南芥中参与叶片生长调节外，在玉米、小麦等[14]植物中同样具有重要作用，如miR156/166通过靶标HD-ZIP基因控制叶片的发育极性[15]。越来越多的研究证据表明miRNA在植物发育时序的转变中具有重要的调控作用，如miR156可作为一个分子标记去判断植物发育阶段[16]，miR156和miR172通过调控不同SPLs表达情况，从而促进拟南芥从营养器官向生殖器官的转变[17]。

在植物的生长发育过程中，miRNA通过影响信号转导通路中的一些关键因子，调控植物体内的代谢平衡，从而影响植物特定器官的形成和发育。例如miR475/476通过作用于植物的PPR靶标，从而参与调控顶端分生组织细胞的不对称分裂和细胞的线性伸长[18]；miR159作用于转录因子MYB，调控天冬氨酸和天冬氨酰的合成以及花瓣的向上卷曲等功能[19-20]；在甜叶菊中首次识别到与甜菊糖苷（Steviol glycosides，SGs）生物合成途径有关的miRNAs，并发现其在不同组织中的表达不同，可通过控制miRNAs的表达来提高甜叶菊的产质量[21]。miRNA还能调控植物激素，同时也会受到不同激素的调控，而参与到多种生命过程中，如miR160、miR167、miR393调控生长素响应因子或生长素受体[22-23]，而miR159通过调控多种激素对细胞的命运起决定作用[24]。研究发现，与动物miRNA相比，植物miRNA更具有保守性，这更有利于依据生物信息学及高通量测序等方法进一步对其靶基因进行预测，另外，多数miRNAs具有较高的组织特异性和时空表达特异性[25]。植物多倍化不仅能够保持植物有稳定的基因组，还能够随环境的变化分化出新的基因，以保证物种的延续。研究发现miRNA能参与影响植物多倍化，如在不同倍性的甘蔗品种[26]中，其miRNA表达具有特异性，推测甘蔗倍性可能与miRNA的表达有关。

在多种植物中发现miRNA能调控植物响应生物及非生物胁迫。如Zhao等[27]对芍药不同抗性品种中差异表达的miRNA鉴定发现miR5254、miR6450a和miR3897-3p参与芍药对葡萄孢菌感染的响应。miRNA还被证实能够干扰昆虫的正常发育，有助于对抗植物害虫。例如利用miRNA深度测序技术，在斑点翅目昆虫中鉴定了127个保守miRNA，其中的11种能够影响幼虫的发育[28]，另外，Sex-miR-10-1a、SexmiR-4924和Sex-miR-9分别在幼虫期差异表达，具体机制还有待于进一步的研究。非生物胁迫包括盐胁迫、旱涝胁迫、温度胁迫、营养胁迫等，植物能够通过一定程度的上调或下调miRNA的表达来适应这些胁迫。在植物中适量盐分能够促进生长，而高盐则严重抑制生长[29]，在拟南芥中发现，高盐下miR397表达量上调，而其靶基因CKB3的表达显著下调，同时，在耐盐品种中miR397过量表达而在敏感品种中表达量较低，即miR397参与拟南芥的盐度应答调节[30]。干旱制约着世界上大部分地区的农作物产量，不同植物在生长发育的各个阶段可能受到不同miRNA的调控[31]。在水稻等植物中发现miRNA169的靶标GmNFYA3在干旱胁迫下表达上调，即miRNA169能够参与植物的抗旱胁迫。在甜高粱中发现5个miRNA169同系物[32]，分别为sbi-MIR169c、sbi-MIR169d、sbi-MIR169.p2、sbi-MIR169.p6和sbi-MIR169.p7，它们可能参与抗旱性甜高粱的不同生命过程，对未来培育抗旱甜高粱品种具有非常重要的作用。在拟南芥中发现，植物激素ABA的诱导也与干旱胁迫有关，即有多种因素共同参与着miRNA对植物的调控[33]。低温会严重抑制植物的生长，甚至会导致植物大量死亡，响应低温的miRNA主要通过间接作用于一些转录因子或直接作用于靶基因的方式响应低温胁迫，如miR156/165、miR167/168、miR393/394/395等。在低温下对不同植物（如水稻和拟南芥）中miR168的表达情况研究发现[12]，水稻中miR168表达量下调而拟南芥中却是相反的上调趋势，可能miRNA在低温胁迫下的调控方式较为复杂，在不同植物中表现不同。miRNA还可参与植物营养胁迫，如miR169调控植物氮素循环[34]；miRNA399能够感受低磷胁迫从而稳定体内磷[35-36]；miR395能够调控硫的代谢和转运[37]等。

1.2 lncRNA

lncRNA是真核生物中长度大于200个核苷酸且不具备编码蛋白质功能的一类RNA分子，在生物体内含量丰富并主要集中于细胞核内[38]，占总RNA的4%～9%，没有开放阅读框，常具有mRNA的结构特征，但比mRNA的表达丰度低[39]。依据lncRNA在基因上的位置[40]可简单分为5类，即正义链和反义链lncRNA、双向lncRNA、基因内lncRNA和基因间lncRNA。近些年的大量研究表明，这类lncRNA不仅能在转录、转录后及表观遗传水平上调控基因表达，还能参与基因组印迹、染色体重塑、转录激活等生命过程，在真核生物的生长发育、逆境胁迫应答等生物学过程中发挥着重要作用。

目前lncRNA在动物中的功能、作用机制等方面的研究较深入，在植物中虽已鉴定出多种lncRNA，如拟南芥[41-42]、棉花[43]、玉米[44]、蒺藜苜蓿[45]、黄瓜[46]、向日葵[47]等，但具体关于生物学功能特性的研究仍仅限于一些模式植物。如拟南芥在春化过程中能够诱导开花抑制基因FLC（flowering locus C）产生lncRNA[48-49]：冷协助内含子区非编（COLDAIR）和冷诱导反义RNA（COOLAIR），它们能够在春化过程中过量表达并通过甲基转移酶抑制FLC的活性，从而调控光周期，当敲除这些lncRNA后，即使经过春化作用但是植物仍然晚开花。

另外，研究发现，促进杂种水稻发育的主要成分是一种光周期敏感的雄性不育（PSMS）突变体，其生育力受到日长的调控。Ding等[50]发现了一种长度为1236个碱基的lncRNA，即长日特异性雄性受精相关RNA（LDMAR），被证实能够调控水稻中的PSMS位点，调节光周期敏感的雄性不育，它的发现能够帮助我们理解植物中雄性生殖光周期调控的遗传和分子机制。有研究表明lncRNA也可参与植物的非生物胁迫，例如通过构建cDNA文库的方法对豆科植物M.truncatula[51]进行全基因组高通量测序，在其叶片和根系中鉴定出了一些对渗透性和盐胁迫敏感的lncRNA，叶片中有2236和2477个lncRNA分别在渗透胁迫和盐胁迫下表达上调，同时有475个lncRNA在这两种胁迫下的表达模式相似；在根系中发现，分别有28和213个lncRNA表达上调和下调，比较有趣的一点是这些lncRNA在响应渗透胁迫和盐胁迫时，在不同的组织（如根系和叶片）中表达可能具有差异性[52]，这可能说明lncRNA在植物中呈现一定的组织特异性。虽然目前对lncRNA在植物非生物胁迫反应中的生物学功能知之甚少，但lncRNA仍然被认为是可以增强植物抗性、改良植物品种的有效工具。研究发现lncRNA的表达具有时空特异性，一般情况下表达水平较低，但在一些逆境（如干旱胁迫或盐胁迫等）条件下，其表达量会发生较大的变化，以帮助植物抵抗逆境。在拟南芥中发现DRIR（drought induced lncRNA），可作为一个正向调控的lncRNA，通过过量表达来调控植物逆境反应[53]。

1.3 cir RNA

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类具有闭合环状结构的单链非编码RNA分子，主要由外显子转录产物组成，广泛存在于真核生物中，并具有结构稳定性和组织特异性等[54]特点。同时，circRNA功能多样，一方面可以作为miRNA“海绵”，隔离翻译起始站点，从而导致线性mRNA无法翻译，调控miRNA表达；另一方面，可以与蛋白互作从而参与植物生长、抗逆等相关途径的调控[55]等。

cirRNA存在于生物界中绝大多数物种当中，在人和动物方面circRNA的相关研究比较多，但是在植物中circRNA的相关报道比较少，自20世纪70年代在植物病毒[56]中首次发现之后，直到2014年才在模式植物拟南芥[57]中发现，目前已有10多种植物circRNA被研究报道，包括单子叶植物水稻、玉米等，双子叶植物拟南芥、大豆、马铃薯等[58]。最近的研究发现，植物circRNA不仅存在于核基因组序列中，在线粒体和叶绿体的基因组序列中同样存在，即circRNA也参与光合作用和呼吸作用的调控。目前，对植物circRNA在某一植物细胞中选择怎样的形成方式以及在某种情况下具体的调控方式我们还不清楚，关于这方面的研究较少，有待于进一步研究。

circRNA在结构上因其环状结构而具有较强的稳定性，不易被核酸酶降解，这个特性也可用来判定RNA是否成环。另外，circRNA在植物体中的表达具有时空特异性[59]，比较拟南芥中的10个circRNA在生长期、成熟期和衰老期的表达情况，发现不同时期circRNA的表达丰度存在差异，可能出现不同程度的上调或下调。同一植株不同部位间circRNA的表达还存在组织特异性，如大豆[60]根系中circRNA的表达比例为49.3%，而在茎和叶片中的表达比例分别为30.6%和9.0%，显著低于根系中的表达量，推测可能与根系的某种特有功能相关。目前已知的关于circRNA功能最典型的是作为miRNA海绵体（sponge），即通过竞争性结合的方式抑制miRNA和靶标结合的能力，如ciRS-7[61]具有70个miR7结合位点，通过与miR7的结合而降低miR-7活性，从而增加其靶基因的表达。另外，近年来已发现多种方法可对植物circRNA进行预测，如骆甲[62]综述了拟南芥、水稻、大豆等目前已知的7种植物circRNA的信息，包括它们的测序部位和数据库来源，并对已发表的基于各种算法的10几种预测软件如CIRCexplorer、find_cir和MapS-plice等进行了多种功能的比较，发现不同的预测方法侧重点不同，得到的结论可能相差较大，使用时要综合考虑各种因素，以期获得最好的效果。

1.4 ceRNA联合调控网络

竞争性内源RNA假说是由Salmena等[63]在2011年提出的，描述了mRNA、lncRNA等各种类型的RNA共同组成复杂的转录后水平调控网络。在这些RNA上有一个或多个可以与miRNA进行结合的小段序列，结合的这个区域被称为miRNA反应元件（miRNA response elements，MREs），它们发挥着miRNA海绵的作用来抑制其他RNA的功能，具有相同MREs的RNA能够与共同的miRNA结合，从而发挥相互调控作用。ceRNA（competing endogenous RNAs，竞争性内源RNA）不是某种新的RNA分子，而是RNA之间的一种调控机制，是指各种类型的RNA转录物通过miRNAs反应原件（MREs），竞争结合共同的miRNA以达到相互调控的目的。RNA之间共有的MRE种类越多，竞争性内源关系就越强。mRNA和一些非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）都可作为ceRNA，通过竞争性结合miRNA位点来进行相互调节。其中，往往是lncRNA通过与miRNA的结合来隔离miRNA，从而降低了miRNA对mRNA的调控，促进mRNA的表达。

2 甜菜非编码RNA

近年来，关于拟南芥、水稻等几种模式植物的非编码RNA研究越来越多，但针对甜菜的相关研究有限。

2.1 甜菜非生物胁迫miRNA相关研究

孙宗艳等[64]深入研究了不同品种的甜菜幼苗在盐或干旱胁迫下miRNA160/164及其靶基因的表达情况，利用高通量测序与生物信息学相结合的技术预测得到甜菜miR160的靶基因ARF17/18，miR164的靶基因为NAC（21/22）/100。通过克隆与抗逆性相关的P5CS（1-Pyrroline-5-Carboxylat Synthetase）基因的cDNA序列，对盐或干旱胁迫下miRNA160/164的表达进行分析，结果表明随着处理时间的延长，miRNA160/164的表达显著下调而其靶基因的表达同时段显著地上调，即miRNA160/164参与甜菜的盐/干旱胁迫应答。营养物质的供给会密切影响甜菜产量，在养分胁迫（如硫酸盐缺失）[65]的条件下，miR395可作为一种生物标志物，来衡量甜菜的营养状况，如硫酸盐缺失的甜菜幼苗其叶片和根尖中的miR395表达量会明显增加。甜菜与其他作物相比具有非常强的耐盐性，生长期的甜菜在含盐0.6%～0.8%的土壤中仍能生存，但不同品种之间耐盐性有极大差异，因此李鹤男等[66]从分子水平上利用DDRT-PCR和银染技术对在正常和高盐条件下甜菜3对真叶期叶片的mRNA进行差异显示分析，结果得到12条与甜菜耐盐性相关的cDNA片段，可能涉及到叶绿体mRNA及tRNA、NADH脱氢酶等。在此研究的基础上，李俊良等[67]利用生物信息学技术对甜菜中耐盐相关的miRNA进行预测，得到了42条成熟miRNA以及23条pre-miRNA，它们来自14个MIR家族，分别涉及甜菜的生长发育、胁迫应答等多种生理过程。另外，利用直接克隆和深度测序以及基于同源的比较基因组表达序列标记（EST）等方法，对甜菜中的保守miRNA及其靶基因进行了计算机的识别和鉴定发现，通过与miRBase数据库的28645个不同物种的miRNA进行识别比较，预测得到了13个甜菜候选miRNA和它们的25个靶基因，这些靶基因涉及信号转导、代谢与应激、生长发育等[68]过程。这些研究提高了我们对甜菜中miRNA分子机制的认识，有助于开发新的技术以提高甜菜产质量。

2.2 甜菜病毒相关miRNA研究

miRNA能够抵御植物病原体的侵染，但其表达可能会受到植物病毒的影响。例如伊朗甜菜曲顶病毒（Beet curly top Iran virus,BCTIV）能够引起作物叶片卷曲病，最近在番茄中[69]发现其编码的包括mir319、mir1919和mir159在内的几个miRNA/miRNA*编码的序列可能与BCTIV转录本结合。这提示植物miRNA/miRNA*在宿主-病毒相互作用以及防御应答中可能发挥重要作用。甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）是一种多段正链RNA植物病毒[70-72]，由4～5个RNA单链组成，其中较小的单链RNA3是含有20个核苷酸的核心蛋白基序，能够编码亚基因组非编码RNA（ncRNA3），它的这些核苷酸能够稳定RNA3（ncRNA3）并维持其长距离运动。ncRNA3的积累在植株全身感染中起着至关重要的作用，但是ncRNA3在BNYVV生命周期中的其他作用尚不清楚。BNYVV会通过土壤传播的多粘菌原虫，引起甜菜丛根病（Rhizomania），导致甜菜糖分减少，死亡率增加，严重影响甜菜的产质量。刘俊莹等[73]通过小RNA深度测序，在被BNYVV侵染的大果甜菜中发现了来自38个miRNA家族的103个已知miRNA和45个潜在的新miRNA，这些miRNA能够参与激素合成及信号传导等生物途径，这些发现对理解BNYVV的致病机制以及提高甜菜的抗病性具有重要意义。

2.3 甜菜lncRNA相关研究

在开花领域的研究进展表明，一些非编码RNA在决定开花时间方面发挥着重要作用。春化过程对甜菜从营养生长到生殖生长之间的转换具有重要作用，最近发现3种可能与甜菜春化机制相关的lncRNA[74]（AGL15X1、AGL15X2和CAULIFLOWERA），对它们在春化作用下的表达进行了验证，确定了AGLX2是甜菜lncRNA的一个候选基因。通过研究相关基因与lncRNA之间复杂的调控机制，有助于提出一种新的甜菜互补开花模型，从而为今后甜菜春化机制的研究开辟了新的可能性。lncRNA可能对甜菜生长及代谢存在多种调控机制，但这些都是未知的，有待于进一步研究挖掘。

3 展望

随着技术的发展进步，植物非编码RNA的研究取得了巨大的成果，未来可能有更多的非编码RNA被发现命名，但是与动物方面的研究相比，植物中许多方面的研究还处于初步探索阶段，更为具体的结构和复杂的调控机制还研究得不够深入，各种研究方法和实验程序也不够完善，有些研究目前还仅限于几种模式植物。甜菜作为世界第二大糖料作物，目前从非编码RNA角度对甜菜进行研究的资料比较少见。积极研究甜菜中非编码RNA的种类及调控机制，对于提高甜菜产量和抗逆性具有重要意义。