T细胞DNA甲基化在部分皮肤病中的研究进展

吴明顺 周伏圣 张学军

表观遗传学是指DNA序列不发生改变的情况下，可调控基因表达的一种可遗传的改变，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等。研究表明，表观遗传学与多种疾病的发生发展密切相关，也是常见皮肤病免疫调节的重要机制之一[1,2]。DNA甲基化是表观遗传学研究的重要内容，本文介绍T细胞DNA甲基化与免疫相关性皮肤病发病机制的相关性研究。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是生物体调节基因表达的表观遗传修饰方式之一[3]，其主要存在方式包括:5-胞嘧啶甲基化(5-mC)，5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)和5-胞嘧啶甲酰(5-formylcytosine，5-fC)。人类中最广泛存在的表观遗传修饰是胞嘧啶甲基化[4]。近期研究表明越来越多的人类疾病与DNA甲基化有关[6]，如肿瘤、2型糖尿病、痴呆等[6-8]。其中人类初级细胞和癌细胞的比较也发现了多个差异性甲基化区域， DNA甲基化在胚胎发育、转录、染色质结构、X染色体失活、基因印记和染色体稳定性方面具有重要的调控作用，特别是最近对哺乳动物基因组多个序列CpG甲基化分布分析发现DNA甲基化和去甲基化维持在生殖细胞和早期胚胎中的新模式，这将进一步解释哺乳动物基因组甲基化模式维持的新机制[9-11]。研究还发现DNA甲基化状态的转变通常与基因组标记相关，包括转录起始位点和内含子-外显子连接处，而甲基化连同特定的组蛋白标记富集在外显子区域表明染色质状态可预示成熟mRNA的含量[10,12]。随着表观遗传学研究的不断进展，利用甲基化芯片技术测序、甲基化免疫共沉淀测序和BS(Bisulfite Sequencing)等方法可以进一步发现及验证人类疾病基因组中DNA甲基化位点差异，这将为早期疾病进展预测及与表达遗传调控关联研究提供了有利的平台。

2 皮肤病与T细胞DNA甲基化

皮肤是人体与外界接触的最重要的屏障组织，不断受到各种外来因素的攻击，皮肤组织的免疫调节机制是抵抗外界入侵的重要方式。研究表明与常见的免疫相关性皮肤病相关的T细胞包括细胞毒T细胞(CD8+T细胞)、CD4+T细胞(Th1、Th2、Th22、Th17、Th9、Tfh和Treg细胞)[13-15]，他们通过多种方式(如甲基化修饰、细胞因子活化、基因通路异常)参与疾病相关的免疫炎症反应[16-21]。而其中T细胞DNA甲基化在免疫性皮肤病中的调控作用是从基因水平上进行深入研究的，这将有利于从遗传角度来对疾病进行多因素评估。以下主要针对常见的几种皮肤性疾病T细胞DNA甲基化予以综述[15]。

2.1 银屑病与T细胞DNA甲基化 银屑病是炎性T细胞介导的免疫相关性皮肤病，累及世界人口的2%～3%，美国和加拿大中患病率较高(分别为4.6%～4.7%)，而在非洲、亚洲人群中则为0.4%～0.7%[22,23]。近几年对银屑病DNA甲基化表达遗传调控的研究越来越广泛。2013年国内的陆前进团队利用免疫共沉淀测序技术进行全基因组测序，发现了多个差异性甲基化区域，其中高甲基化验证基因PDCD5和TIMP2低表达，而后张学军团队又发现了9个新的差异性甲基化位点，其基因CYP2S1、ECE1、 EIF2C2、MAN1C1、和 DLGAP4表达与甲基化成负相关，该团队同时利用全基因甲基化数据发现了DNA甲基化可以控制基因遗传变异[26-28]。而对于免疫性CD4+T细胞在初始CD4+T细胞的极化期间，其DNA甲基化在基因转录调节中也起着重要作用[29,30]。2012年，Han等[31]研究银屑病患者初始CD4+T细胞全基因组DNA甲基化，发现与正常对照组相比，银屑病患者初始CD4+T细胞在10个不同染色体基因组范围大小从10到70 kb的26个区域里表现出明显的低甲基化，而在X染色体上121个基因(包括SLITRK4、EMD、ZIC3、CXorf40A、HDAC6、IKBK等)的启动子区域表现出显著性的高甲基化水平。这些变化意味着初始CD4+T细胞可能易于在遇到抗原之前诱发银屑病，这可能跟不同的环境因素有关，而银屑病受环境因素影响从而引起DNA甲基化变化。之后Park等[32]发现银屑病患者CD4+T细胞甲基化值偏高，特别是在启动子区域，同时从该启动子区域高甲基化基因中挑选表达水平降低的基因(PPAPDC3、TP73、FANK1和CATSPER2)进行抑制剂-5-氮杂胞苷处理，发现基因表达水平上升。表明银屑病患者CD4+T细胞DNA甲基化参与调控基因表达，从而参与银屑病的发病机制。Gervin等[33]分析患银屑病的同卵双生子在CD4+T和CD8+T细胞水平上DNA甲基化和基因表达水平差异性并作比较。对患病双生子和未患病双生子CD4+T细胞和CD8+T细胞DNA甲基化和基因表达综合分析发现，DNA甲基化差异与基因表达差异具有显著相关性的基因(如LDHC、IL13、TNFSF11、MGC3207、CSF2、GIMAP5、GIMAP1、PTHLH、ALOX5AP)，这其中与银屑病相关的基因(IL13、TNFSF11、PTHLH、ALOX5AP )富集于CD4+T细胞中。该基因DNA甲基化在调节细胞因子级联反应和参与银屑病信号通路方面也非常重要。研究还发现与正常对照相比，银屑病患者FOXP3 Treg特异性去甲基化区域高度甲基化，这种FOXP3是调节性T细胞发育的关键调控因子，它的表达与调节性T细胞水平呈正相关[34]。以上研究均表明银屑病患者T细胞甲基化可能通过调控基因表达从而影响银屑病的发生发展。

2.2 系统性红斑狼疮与T细胞DNA甲基化 SLE是一种累及多个器官系统的复发性自身免疫性疾病，其中自身反应性T细胞在SLE的发病机制中发挥着重要作用[35]。2013年，Coit等[36]研究了SLE患者和健康对照初始CD4+T细胞甲基化水平差异，结果在SLE患者初始CD4+T细胞中发现了47个特异性基因中的86个差异性甲基化位点，其中大多数处于低甲基化。研究又发现在这些低甲基化位点中富集了一些干扰素调控基因，包括IFIT1、IFIT3、MX1、STAT1、IFI44L、USP18、TRIM22 和 BST2，而这些低甲基化干扰素调控基因却与疾病活动无关。此外，存在于SLE疾病活动期和静止期的干扰素相关变化表明了表观遗传介导的干扰素变化引发的超敏反应持续时间要超过疾病的急性期，而这些初始T细胞中的干扰素引发的超敏反应则表明SLE患者表观遗传学状态存在于祖细胞群体中[37]。后来的研究发现与SLE疾病活动性负相关的甲基化位点富集于染色体Chr3、Chr17、Chr1，该位点也富含转录因子BATF、FOS、CEBPB、JUN和STAT3；而与疾病活动正相关的位点则富集于含抑制性转录因子EZH2和SUZ12的X染色体上。其中关键性转录因子EZH2在活动性SLE患者CD4+T细胞表观遗传构象变化方面起着关键作用[38]。研究初始T细胞甲基化是为了更好的发现与狼疮发病机制密切相关的T细胞表观遗传学变化，从而使导致疾病的环境影响因素和成熟T细胞刺激影响最小化[39]。Zhao等[40]采用hMeDIP-Chip研究5-hmC在特定的基因组位点的表达水平，发现具有高水平5-hmC的2748个基因存在于SLE CD4+T细胞启动子区域，而这些基因明显富集在神经营养因子、WNT、MAPK、钙和mTOR信号通路中。这表明启动子区域中高DNA羟甲基化可能在SLE致病机制中非常重要。研究还发现与正常对照组相比，狼疮患者CD4+T细胞中DNA羟甲基化水平显著增加，可是并没有发现这种羟甲基化水平与疾病活动性有关，但却与DNA去甲基化有关；Zhao等[41]研究还发现了与SLE患者不同临床表型相关的CD4+T细胞特异性DNA甲基化变化，这些变化存在于低甲基化高表达的新型靶向基因NLRP2、CD300LB、S1PR3，以及一些关键通路(黏附连接和白细胞跨内皮迁移)。另有研究发现，活动性SLE患者FOXP3 TSDR高度甲基化，并且pSTAT5a表达水平显著增加，这些都与SLE疾病的活动性直接相关[34,42]。除此之外，研究发现T细胞亚群Th17和调节性T细胞介导的免疫应答在SLE发病机制中也可能发挥着重要的作用[43]。以上表明SLE患者T细胞甲基化或者羟甲基化可能通过影响基因转录水平以及基因通路从而影响疾病活动性及进展。

2.3 系统性硬皮病及原发性干燥综合征与T细胞DNA甲基化 SSc及pSS都是病因及机制不明的涉及多因素的自身免疫性结缔组织病，而T细胞在该类病发生、发展过程中起关键性作用，其中T细胞甲基化尤为重要。Lei等[44]研究了SSc患者CD4+T细胞整体基因组甲基化状态及其相关基因调控表达，发现与正常对照组相比，SSc患者CD4+T细胞中全基因组DNA低甲基化，并且DNMT1、MBD4及MBD3基因所表达的mRNA水平明显下调。而存在于该细胞的TNFSF7(CD70)基因启动子区域的低甲基化与该基因的高表达水平呈负相关[45]。研究还发现SSc患者CD4+T细胞中的FOXP3基因表达水平降低，该基因调节序列的高甲基化与SSc患者的FOXP3 mRNA表达水平也呈负相关性[46]。这种基因甲基化状态抑制表达可能导致基因通路的异常活化，进而影响疾病免疫稳态。另有研究结果表明女性患者CD4+T细胞表面CD40L高表达，其DNA调节序列低甲基化，二者负关联，但这种差异在男性中却不存在[47]。对于pSS，Yin等[48]研究了pSS患者CD4+T细胞中易感基因甲基化表达水平及调节序列甲基化状态，研究发现与正常对照组相比，pSS患者CD4+T细胞CD70基因启动子低甲基化，其mRNA表达水平显著增高，其中Perforin基因的mRNA水平也显著增高。这些研究结果表明了SSc和pSS患者CD4+T细胞甲基化状态及其相关易感基因过表达可能在二者的疾病进展中发挥重要作用。

3 问题和展望

目前免疫-表观遗传学越来越成为国内外研究皮肤病发病机制的重要环节，但对免疫细胞(尤其是免疫性T细胞)甲基化与疑难性皮肤病如银屑病、SLE、SSc、pSS的关系认识还不够广泛和深入。由于免疫性T细胞是淋巴细胞中数量最多、功能最复杂的一类细胞，而DNA甲基化又是一个由多种酶促反应参与的重要的表观遗传学分子机制，DNA甲基化对基因表达起着重要的调节作用，广泛研究T细胞甲基化可更深入了解皮肤病相关疾病的发生、发展机制、为药物靶向作用和临床应用奠定坚实基础，DNA甲基化和DNA羟甲基化在疾病机制方面的研究贡献也值得进一步推进。