甜菜粕生产部分高附加值产品的研究进展

李红侠，吴则东，兴旺

（黑龙江大学农作物研究院/中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨150080）

0 引言

甜菜粕（sugar beet pulp，SBP）是一种生物质能，也是一种再生能源。生物质被认为是化石燃料的潜在替代品而引起了世界各国的极大兴趣。近些年来，国内外科研人员对再生能源的研究越来越深入，而再生能源的研究在欧盟的发展速度最快[1]。越来越多的木质纤维素生物质被用作了生物技术加工的基质，生物质中的碳水化合物分解时释放出来的产品可被微生物转化成有价值的化合物，这些化合物主要用于生物燃料和有机酸等的生产[2]。甜菜是法国、德国、土耳其、波兰、俄罗斯、乌克兰、美国和中国等国的重要经济作物。大约660 kg甜菜能生产100 kg糖，同时可产生330 kg湿SBP和25 kg糖蜜副产品[3]。美国的甜菜工业每年可生产4亿多吨湿SBP，合干SBP约100万吨[4-5]。SBP中主要含有纤维素、半纤维素和果胶，这些物质占干物质的75%～85%，其中纤维素（22%～30%）、半纤维素（24%～32%）、木质素（1%～2%）和果胶（15%～25%）及 25%的其他成分（包括10%～15%蛋白质、1.4%脂肪、3.7%灰分等）[4-6]。若将农业废弃物、低用途副产品转化为财富、高附加值产品，对充分利用废弃资源并保护环境，扩大甜菜综合利用无疑有极其重要的意义。过去甜菜粕主要用作动物饲料，其利用的价值没有充分体现出来。近年来随着科技的不断发展及研究技术方法的不断深入，SBP作为提取、生产多种工业产品的原材料受到了国内外研究者的广泛关注。越来越多的研究表明SBP可转化开发为诸多高附加值的生物产品，如聚乳酸[6-8]、生物乙醇[1]、甲烷[4]、氢气[9]、乳酸[10]、丙二醇[10]、阿魏酸[11]、阿拉伯糖（Ara）[12-13]、半乳糖醛酸（GalAc）[14]、低聚糖[15]、庚酮糖[16]等；此外还有聚酯、聚酰胺或增塑剂[14]、复合材料、酶类（果胶酶、维生素酶、蛋白酶、脂肪酶、蔗糖酶等）[17]、蛋白质[18]等；一些螯合剂和抗生素类等很多高附加值生物质产品都可以从SBP中加以提取[19]。因此本文概要介绍一下SBP聚合糖类降解方法及糖类、乙醇、氢、蛋白质等的开发研究进展，使SBP的开发利用及价值得到更多的关注。

1 甜菜粕中糖类的生产

甜菜粕主要由纤维素（聚葡萄糖）、果胶（一种多糖和戊糖共聚物）及木质素（＜3%w/w）和蛋白质（11%w/w）组成[16]。SBP中水解聚合碳水化合物可生产单糖，这是提高甜菜副产物进一步利用且价值增值的一个很关键的步骤[14]。甜菜果胶是由聚合D-半乳糖醛酸即L-鼠李糖（Rha）基及D-半乳糖醛酸（GalAc）残基交替组成的主链和两种不同类型的侧链组成的线性框架，即是线性半乳聚糖和高度支化的Ara[20]。SBP中主要单糖为D-葡萄糖（Glu）、L-Ara和D-GalAc，Glu易被微生物发酵。GalAc和Ara不是发酵所需的碳源，它们作为重要的中间物质，可进一步转化为高价值的生物化学品或材料，如聚酯、聚酰胺或增塑剂[14]。Ara是一种制药和在工业中有机合成的重要中间原料，是许多生物活性物质结构如抗生素的前体，在绿色健康食品生产中，Ara对蔗糖的代谢转化具有阻断作用[21。已证明Ara对酯化后的生物聚合物的生产起到了一定的作用，它也可被还原为阿拉伯糖醇，为生物质中12种附加值最高的化学物质之一，可用作不饱和聚酯树脂的原料[16]。此外，将Ara转化为GalAc药物原料的化学方法也已被开发，也是生产超支化聚酯和塑化剂的重要组成部分[22-23]。

Ara是甜菜果胶中存在的主要单糖，因此它是催化改质的关键初始原料，它可以通过酶分馏和酸水解来回收[16]。研究表明，采用亚硫酸对SBP进行预处理，可以实现糖类的高效提取和剩余固体的酶解。低浓度（0.6%～1.0%）的亚硫酸作为水解剂，在短时间内（10～20min）和低固液比（1∶3、1∶6）条件下，可有效地从 SBP中提取糖类，并对随后的酶解产生积极作用。水解产物中还原物质的最高浓度可达8.5%，并可提取出33.6%的糖类。获得的单糖主要是Ara和Glu（分别为9.4和7.3 g/L）。若用亚硫酸4.6倍预处理湿SBP，SBP预处理及后续酶解Glu的总收率为理论值的89.4%[24]。SBP经草酸水解制备Ara的最佳工艺条件为：草酸质量浓度为1.5%，水解时间2.5 h，水解温度为105℃，最优条件下Ara的获得率为1.26%[12]。SBP经全酸水解后，其碳水化合物组成为：25.9%D-Glu、23.0%L-Ara、14.4%D-GalAc、6.2%D-半乳糖 （Gal）、2.4%L-Rha、1.7%D-木糖、1.0%D-甘露糖和25.4%的其它物质。Ara、GalAc和Glu占总单糖总量的85%。因此，这3种单糖的利用是SBP分馏和生物转化研究的重点[25]。通过蒸汽爆破（SE）后，在高压釜中加入2.5%（v/v）硫酸，加热至121℃1 h，再用NaOH调节pH值为6，溶解的果胶部分完全被水解。该粗水解材料的总溶解固体含量约为100 g/L，总糖浓度约为20 g/L，还含有未知颜色的杂质[16]。粗水解的SBP混合物经离心分离色谱（CPC）分离。建立了乙醇-硫酸铵（0.8∶1.8 v/v）的两相体系，在两相体系形成期间，用于分离单糖，去除粗品中的有色杂质，彩色杂质在单糖类Rha、Ara、Gal和GalAc出现之前会被完全洗脱[26]。在生物炼制过程中，可从CPC中提取3个主要组分，可在33～45 min内收集Rha，回收率为93%，纯度为92%；由于Gal的共洗脱，在46～66 min内可收集到Ara，回收率为97%，纯度为84%；最后，78～100 min分离到GalAc，回收率超过95%，纯度为96%。CPC是一种很有前途的生物炼制应用分离技术，它允许粗加工，水解SBP促进杂质去除和单糖分馏，尤其可分离出两种主要的单糖Ara和GalAc，其收获率和纯度也较高[16]。

在高温条件下，传统的半纤维素水解方法主要采用强酸和强碱，它对周围环境造成的破坏程度很大[15]。因此考虑到采用酶解的方法，由于酶具有高度的特异性和选择性，是可生物降解的，且产生的废物也较少，对环境不会造成破坏，所以被广泛应用于工业生物催化剂的研究[27]。L-阿拉伯呋喃糖酶（AF，EC 3.2.1.55）是一种外型糖苷酶，其催化可连续去除a-1,2-、a-1,3-、a-1,5-和a-4,6-连接Ara残基的非还原性末端[28]。为了从SBP果胶的阿拉伯基侧链中释放Ara单体，Cárdenas-Fernández等从热葡萄糖苷吉杆菌中鉴定并克隆了一种耐热L-阿拉伯呋喃糖苷酶（AF），它能水解不同来源的天然Ara，如甜菜果胶，产生单体Ara和完整D-半乳糖醛酸框架（GABB）[16]。在蒸汽爆破（SE）之后，甜菜果胶作为主要完整的聚合物以可溶的部分回收。这就要求进一步水解释放主要的果胶单糖：Ara和GalAc。使用AF尝试将果胶的阿拉伯胶侧链的选择性解聚，这将产生可溶性单体Ara，使聚合物GalAc框架（GABB）保持完整[16]。从聚合物GABB分离的Ara单体，在食品和（生物）药物中得到了良好的利用[29]。选择性酶分馏可使甜菜果胶完全酸水解，然后通过应用高分辨分离技术同时分离所有果胶单糖[16]。

用木聚糖酶和硫酸水解SBP生产Ara和低聚糖的研究表明，Ara占酶酸解总产物单糖含量的48.4%，而SBP经木聚糖酶水解产物的低聚糖含量较高，该研究为Ara和低聚糖的制备开辟了一条新的途径，也为低聚糖的生产提供了一种探索的方法[15]。木聚糖是自然界中主要的半纤维素成分，其主要成分是戊糖(D-木糖和Ara)，其次是己糖(D-Gal、D-Glu和D-甘露糖)以及糖醛、乙酸和肉桂酸[30]。内木聚糖酶和木聚苷酶与AF、阿魏酸酯酶、糖醛酶一同作用，可实现木聚糖的完全解聚[15]。木聚糖酶水解半纤维素为低聚糖，水解液用稀酸(2%H2SO4)进一步水解，SBP水解液中含有少量的糖，如Glu、木糖和Ara，3种糖的含量分别为2.7%、2.2%和4.6%，其中Ara含量明显高于Glu和木糖水平，其干重占甜菜残渣的2.76%15]。通过酶稀酸或唯一酶水解，从廉价的SBP中提取糖类，是将农业废弃物转化为财富并充分利用废弃资源、保护环境的有效途径。

糖化后剩下的纤维素可作为生物基纤维或纳米复合材料再次加以利用。因此，纤维素在水解过程中的降解是有利的过程，在GalAc和Ara从SBP中得到最佳释放的同时，又保持纤维素的完好无损，这是一个非常理想的生物转化过程[14]。在生物炼制环境中，酶可以用来分解从复杂原料中释放出来的聚合物，典型的例子就是纤维素酶可以将纤维素解聚成D-Glu单体并进一步用于合成其它物质，例如，生产对称性氨基醇。纤维素酶已经被用来商用，转酮醇酶（TK）和转氨酶（TAm）已被用于对称性氨基醇合成的克隆和生产[31]。TK是硫胺素二磷酸（ThDP）的依赖性酶，已被用于立体定向碳-碳键的形成上[32]。当使用b-羟基丙酮酸（HPA）作为酮醇供体时，TK能在CO2缺失下不可逆转地进行反应，这使其成为在工业合成中很受青睐的生物催化剂[22]。Ara作为TK的醛受体，将产生L-葡萄糖-庚酮糖（GluHep），催化不对称碳-碳键形成的转酮醇酶(TK)和催化选择性胺基转移转氨酶（TAm），其在合成一系列该类产品时特别有用[23]。特别是将Ara转化为L-葡聚糖-庚酮糖(GluHep)，其在低血糖和癌症的治疗中得到了应用，因此该化合物的商业利用价值极高[33]。对内部TAm库的筛选研究表明，紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的u-TAm可进一步将GluHep转化为相应的对称性氨基多醇-2-氨基-L-葡萄糖-庚酮糖[16]。TAm可将GalAc转换成6-氨基-2，3，4，5-四羟基己酸，其可用于合成生物聚合物，如聚羟基聚酰胺，这种聚合物可作为一种强效抗病毒聚羟基氮杂环的合成原料[34]。

2 甜菜粕用于乙醇的生产

甜菜粕除了用于动物饲料外，糖厂还主要用来生产乙醇。半纤维素是第二丰富的植物多糖，是生产生物乙醇的一种较为理想的能源原料[30]。通过对废SBP进行酶法解聚，得到的酶解产物再经过发酵处理即可以生成乙醇。在乙醇的生物合成过程中，利用SBP中释放的大部分碳水化合物做为原料与酿酒酵母-乙醇红和Sch.stipitis LOCK0047进行反应得到12.6 g/L乙醇[9]。当生物质中的碳水化合物分解时释放出来的产品可被微生物转化成有价值的化合物，易降解的生物质资源常被用来生产生物乙醇[35]。通过酸预处理的方法可使SBP酶消化率从33%（原料）提高到93%（处理），其在最佳预处理条件（温度120℃，酸浓度0.66%，固体负荷）时酶解产率为93%，总还原糖产率为62%。在最佳条件下，用大肠杆菌KO11进行同步糖化发酵（SSF）工艺SBP预处理后的乙醇产率为0.4 g乙醇/g干物质[36-37]。采用不同温度下的氨水预处理可促进SBP的酶解，当SBP在80℃下经氨水进行6 h预处理时，还原糖产率最高（448.52mg/g），比粗SBP提高了2.42倍，氨水预处理提高了SBP的酶消化率，这是SBP生产乙醇的一种很有前途的方法[37]。通常常用的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）不能同化Ara[35，38]。商业化通用的菌株，特别是蒸馏酵母，不能代谢戊糖。这些碳水化合物在乙醇发酵后以酒糟的形式作为生物质废物存在[39]。

Glu和木糖的释放可分别由酿酒酵母S.cerevisiae和Sch.stipitis进行发酵[40]。酿酒酵母野生型菌株不能利用木糖，然而，据报道有几个遗传修饰的酿酒酵母菌菌种可发酵木糖合成乙醇。能够发酵木糖的天然酵母物种包括斯氏酵母属Scheffersomyces和假丝酵母属Candida及K.marxianus；由于其天然吸收戊糖和己糖的能力，K.marxianus为第二代乙醇发酵提供了一种替代传统酵母菌的一种选择[41]。酿酒酵母（S.cerevisiae）常用于蒸馏工业并用于淀粉原料水解液中己糖（包括Glu）的发酵[2]。K.marxianus则能够利用各种基质如木糖、Ara、纤维二糖、甘油、木糖醇、乳糖和菊糖进行发酵，这适合于含有混合碳源原料的发酵。此外，K.marxianus还可以利用戊糖和己糖进行细胞物质量合成，将Glu发酵为乙醇[42]。Sch.stipitis具有发酵许多糖类的能力，比如Glu、Gal、甘露糖、木糖和纤维二糖等[43]。多数酵母菌都能代谢木糖，只有1%的菌株能将木糖发酵为乙醇。因此，Sch.Stipitis是半纤维素生产乙醇的一个很有发展前途的菌种[44]。当用酿酒酵母（S.cerevisiae）和K.marxianus NCYC179的单一培养物进行发酵以及这些酵母菌菌株的混合培养时，乙醇的产量较低；而用酿酒酵母（S.cerevisiae）和Sch.stipitis发酵的培养基并以SBP为原料水解物的乙醇产量最高[2]。

从技术角度看，发酵糖的含量越高越好，因为这有助于从原料中获取较高的乙醇产量。但是，它需要使用耐多种过程胁迫的酵母菌株，包括乙醇胁迫和高糖浓度引起的渗透胁迫[45]。此外，酵母细胞有其特定的生长要求，因其不均衡或环境限制可能导致不完全发酵。这些环境限制包括特定数量的氮、碳、维生素、氧和金属离子等[46]。从Glu等己糖中生产乙醇已经是一个成熟的工业过程；而使用木糖戊糖等还仍然存在一些挑战[40]。一些研究表明，在含有Gal的培养基中，乙醇的产量不如以Glu为碳源的产量高；而其它的研究却发现，Gal是乙醇生产中比Glu更好的碳源[47]。

对SBP水解物发酵后的酵母菌对碳水化合物利用率的研究表明，所有测试酵母菌株的78%～100%可被己糖（即Glu和甘露糖）消耗掉；果糖的利用率相对较低。酿酒酵母与K.marxianus共培养可使果糖更好地被利用（利用率17%～46%），而与酿酒酵母（S.cerevisiae）和Sch.stipitis发酵的果糖利用率为100%。因此可以认为，Sch.stipitis酵母菌株能够有效地消耗果糖，但目前尚不清楚这种单糖是否被专一代谢成乙醇或者其他产品，碳分解代谢抑制通常发生在含有各种糖的介质中[48]。采用互补菌株混合培养利用碳源，以及控制接种酿酒酵母（S.cerevisiae）和非酵母菌是改善发酵过程的复杂性和生产力的可行途径[2]。

3 甜菜粕制氢的研究

有研究表明，甜菜粕水解物中的非发酵化合物的含量占总碳水化合物的22%～60%不等。这些值取决于酵母菌的种类、发酵方式和水解液的组成[9]。然而，在第二次发酵时，未利用的碳水化合物（主要是棉子糖）含量相对较高，而木糖和GalAc的浓度在发酵过程中增加。这表明SBP、寡糖和多糖进一步水解，其所释放的化合物可作为非发酵碳源，并为随后产生氢气的反应提供重要的原料[9]。制氢是一个非常快速的过程，之后的过程变慢，约为0.5 h，氢气的产生只需两天就能完成；对甜菜酒糟（SBS）经热预处理和pH调节，产氢量最大（252 dm3，H2/kg，挥发性固体，VS）；而对甜菜水解物（SBH）通过热预处理和pH调节，产氢量为229 dm3H2/kg VS，其SBP残留物（SBPR）的对应值仅为150 dm3H2/kg VS[9]。用碱性、热性、微波性、热碱性和微波碱性预处理方法研究SBP暗发酵生产氢，结果表明，碱、微波碱和热碱预处理反应器与其它方法相比，SBP的增溶效果显著，其中碱性预处理的产氢量最大（115.6mL H2/g COD）[49]。在暗发酵制氢过程中，富糖物质在厌氧条件下经产氢及兼性厌氧菌和专化厌氧菌的解聚产生氢，而SBH主要富含Glu（9.79～12.74 g/L），这样在暗发酵过程中可生成较多的氢气[9]。

4 甜菜粕中蛋白质的提取

SBP可以用于蛋白质的提取。用未经处理的SBP及水蒸汽预处理后的SBP和经纤维素酶水解后的SBP进行蛋白质提取对比，水蒸气预处理后可导致蛋白质损失约1%（处理前后对比SBP从8%w/w降到7%），而纤维素酶水解得到的最终不溶性产物随着纤维素的去除而蛋白质富集，与未经处理的原料相比，纤维素酶水解后SBP的单位干重蛋白质百分比从0.08 g/g增加到0.15 g/g。这种经纤维素酶水解后的SBP蛋白质含量明显增加，是家禽等牲畜的理想饲料[18]。在纤维素酶25 U/g，酶解时间6 h时，以面包酵母B188和产朊假丝酵母B204为菌种的最适混合发酵条件下，50 h粗蛋白可达21%，蛋白净增量为14%[50]。

5 甜菜粕的其它利用

SBP中富含有纤维素，纤维素本身具有一定的吸附性，这可作为重金属离子的螯合剂和吸附剂使用[19]。SBP还常用于废水中无机金属离子的处理。利用SBP对废水中有毒有害金属阳离子铊（TI）的吸附过程是快速的，在 pH 值为 5～9 时铊（TI）的去除效率最大（7 g/L）[51]。 此外，赵毅等也报道过 SBP 对 Cr6+、Ca2+和 Pb2+、Fe3+等也具有一定的吸附性能[52]。还有诸多研究报道，SBP被用来提取草酸[53]、聚酯、聚酰胺或增塑剂[14]、动物的消化酶[54]、纤维纳米纤、复合包装膜、果胶[19]等。因此SBP是获得高附加值产品的理想材料来源。

6 展望

国外对甜菜副产品和SBP的开发研究是个热点[55]，特别是在世界各国能源短缺且大力提倡绿色能源的前提下，SBP作为潜在的绿色能源生产原料和可持续发展的潜力会越来越受到重视，而我国在这方面的开发研究却很薄弱，今后应加强。Ara和木糖已广泛应用于食品、医药行业。而目前Ara主要是通过水解稀缺而昂贵的阿拉伯胶生产的，随着Ara需求量的迅速增加和阿拉伯胶资源的限制，Ara的价格会越来越高。因此，利用甜菜粕生产Ara，开发一种更便宜的Ara生产工艺已成为一项紧迫的任务[15]。

如果按照甜菜产生50%的湿SBP计算[3]，我国在2016/2017年榨季生产甜菜956.7万吨，据此推算能产生湿SBP 478.35万吨，合干SBP大约47.8万吨（据英联农业中国统计数据折算），那么该榨季全部SBP就可生产出葡萄糖12.9万吨、木糖10.5万吨及阿拉伯糖22万吨。而且近几年内蒙甜菜糖业稳步增长，甜菜糖和SBP均呈增长趋势[56-57]，这样开发SBP为高附加值产品有足够的原料，必将增加甜菜制糖业的经济效益，有助于实现中国甜菜糖业乃至全制糖行业转型升级、降本增收两个300元的行动目标，提高竞争力[58-59]。

SBP中富含Ara等功能性糖，而Ara作为一种新型低热量功能性甜味剂，在食品、医药领域应用前景广泛。SBP中富含有果胶，果胶又以其独特的分子结构造就了优越的应用特性，它具有胶凝、增稠、稳定和乳化等功能，还具有控制血糖浓度、降低胆固醇吸收、防癌、抗癌等的特殊功效，被广泛应用于果冻、果酱、果汁、酸奶、软糖、保健品等食品及医药行业上[60]。未来以SBP为原料，通过新的生物技术获取高附加值产品的研究开发具有广阔的前景，将一定会大大促进甜菜种植业及其副产品的应用发展。