牙周炎和动脉粥样硬化鼠类模型建立的研究进展

侯敬雅，张冬梅

（中国医科大学口腔医学院牙周科，沈阳 110002）

牙周炎是由菌斑生物膜引发的发生于牙周支持组织的慢性炎症性疾病［1］。动脉粥样硬化 （atherosclerosis，AS） 是大多数心血管疾病的基础，近年来我国因心血管疾病死亡的人数迅猛增加，AS的预防和诊治成为人们研究的重点。流行病学调查［2］显示牙周炎可以增加患心血管疾病的风险，1990年有研究［3］提出了牙周炎动脉粥样硬化综合征 （periodontitis-atherosclerosis syndrome，PAS） 的说法，近年来关于PAS研究逐年增加，牙周炎及AS机制研究需采用一些体外或体内实验来完成。与体外实验比较，体内实验模拟人体内环境，所得实验数据真实、可靠。因此建立牙周炎和AS动物模型显得尤为重要。本文就牙周炎和动脉粥样硬化鼠类模型建立的进展进行综述。

1 AS鼠类模型的建立

AS模型动物有大型动物 （猴、猪等） 和小型动物（兔、小鼠和大鼠等［4-5］） 2种。目前还没有一种AS动物模型能全面、准确模拟人AS病变特征。鼠类具有成本低、易于繁殖、基因操作方便以及能够定期检测等优点，是应用最多的动物［6］。目前AS模型鼠类包括普通大鼠、小鼠。小鼠为以c57BL/6小鼠为基因背景的基因敲除鼠，包括载脂蛋白E基因敲除 （ApoE-/-）小鼠和低密度脂蛋白受体敲除 （LDLr-/-） 小鼠） 等。

1.1 普通大鼠AS模型

鼠类有抗AS的特性，很难自发形成AS病变。高脂饮食可使血脂升高，导致其形成AS早期改变。AUBIN等［7］给大鼠喂饲高脂饮食，持续8周，高脂饮食组出现AS斑块样病变。高脂饮食建立的AS模型操作简单、成本低廉，是建立AS模型常用方法，但高脂饮食造模时间较长，而且高脂饮食有肝脏毒性，会使动物消瘦，期间有可能发生继发感染，从而影响实验的稳定性。因此目前常采用高脂饲养联合其他方法加速AS模型建立。常用高脂饮食联合其他方法包括高脂饮食联合腹腔注射维生素D3、高脂饮食联合腹腔注射维生素D3联合内皮损伤法、高脂饮食联合腹腔注射脂多糖［8-10］。

1.2 小鼠AS模型

最常用AS基因敲除小鼠模型有2种：ApoE-/-小鼠模型和LDLr-/-小鼠模型。

1.2.1 ApoE-/-小鼠AS模型：ApoE是血浆载脂蛋白的重要组成部分，在清除血浆脂质方面发挥着重要作用。ApoE-/-小鼠在高脂饲料喂养后能快速形成AS病变［11］。ZHANG等［12］用高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠16周，组织病理学显示动脉壁有粥样斑块形成及巨噬细胞浸润等，证明AS模型建立成功。ApoE-/-小鼠模型不足之处：（1） 模型与人类脂质谱不同，人类血浆脂蛋白主要为低密度脂蛋白，而小鼠模型为极低密度脂蛋白［13-14］；（2） ApoE蛋白除了介导脂质清除以外，本身也具有抗炎、抗氧化、抗增殖作用，ApoE基因敲除影响AS形成过程，这使AS形成机制的研究更加复杂［5］。

1.2.2 LDLr-/-小鼠AS模型：低密度脂蛋白受体能够结合ApoE蛋白从而清除血中脂蛋白颗粒，同时低密度脂蛋白受体也能通过与低密度脂蛋白颗粒上的脂蛋白B （apolipoprotein B，ApoB） 相互作用，从而清除血中低密度脂蛋白。LDLr-/-小鼠表现为血清胆固醇、甘油三酯水平升高，经过高脂饮食喂养后可以加快AS斑块形成［15］。THOMAS等［16］用高脂饮食喂养LDLr-/-小鼠16周，动脉壁可见AS形成。LDLr-/-小鼠模型不足之处：中间密度脂蛋白和低密度脂蛋白比值较高，这种情况更接近于人的血脂紊乱状态。

2 鼠类牙周炎模型建立

牙周炎模型动物主要有大型动物 （灵长类动物、小型猪、狗等） 和小型动物 （大鼠、仓鼠［17］等） 2种。鼠类牙周组织结构、病理与人类相似，且价格低廉、操作简便，所以目前鼠类是研究牙周炎发病机制应用最广泛的啮齿类动物［18］。常用的牙周炎鼠类模型建立方法有4种：磨牙结扎法、牙龈局部注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、高糖饮食和牙龈局部接种牙周致病菌。

2.1 磨牙结扎法建立牙周炎模型

磨牙结扎法是目前建立牙周炎动物模型较常用的方法［19］。结扎线容易造成食物残渣滞留、菌斑积聚，从而造成牙龈组织红肿出血和牙槽骨丧失［20］。常用的结扎材料有丝线、棉线、尼龙线、正畸用钢丝及弹性橡皮圈等。VARGAS-SANCHEZ等［18］将棉线结扎于大鼠的下颌第一磨牙，结扎后0、3、7、15、30、60 d处死大鼠，发现第3天即出现明显牙槽骨吸收，从第3天到第15天牙槽骨出现持续稳定吸收，第30天到第60天牙槽骨吸收保持稳定，不再有明显骨丧失。磨牙结扎法建立大鼠牙周炎模型不足之处：（1） 引起的是急性牙周炎病变，与人牙周炎病变过程不同；（2） 结扎过程可能造成牙周组织创伤。但因为具有成本较低、操作简单、疾病开始时间明确、结果可预测等优点，磨牙结扎法成为目前建立牙周炎模型首选的方法［21］。

2.2 牙龈局部注射LPS建立牙周炎模型

LPS是革兰阴性菌细胞壁外膜中的成分，是革兰阴性菌具有的一种致病物质，具有很高的毒性和抗原性。LPS可以进入牙周组织导致炎症和牙槽骨吸收。DUMITRESCU等［22］将鼠伤寒沙门杆菌的LPS溶于生理盐水 （10 μg/μL），取0.1 μL注入大鼠上颌第二磨牙颊侧近中的牙龈里，10 d后处死大鼠，病理组织学显示上颌颊腭侧均有明显的骨丧失。牙龈局部注射LPS建立牙周炎模型优点是实验可控性好、节省时间、具有可重复性。不足之处是LPS纯化过程较复杂，而且LPS生物化学功能不稳定。

2.3 高糖饮食建立牙周炎模型

高糖黏性饮食不利于牙齿的自洁，为鼠类口腔中细菌生长、繁殖提供了较有利环境。AGUIRRE等［23］分别采用高蔗糖饮食和标准饮食饲养稻鼠，22周时发现高蔗糖饮食组稻鼠牙周袋深度、牙槽骨高度等临床指标均比标准饮食组差。高糖饮食建立牙周炎模型优点是避免了结扎等造成的鼠牙周组织机械损伤，不足之处是只适用于仓鼠、稻鼠这类牙根之间分叉较小，对牙周炎较敏感的鼠类［17，19］。

2.4 牙龈局部接种牙周致病菌建立牙周炎模型

牙菌斑是牙周炎的始动因子，在牙菌斑中常可分离出一种或几种牙周致病菌，牙周致病菌具有显著毒力或致病性，可造成牙周组织破坏。牙周致病菌主要有牙龈卟啉单胞菌 （porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）、伴放线聚集杆菌（aggregatibacter actinomycetemcomitans，A.actinomycetemcomitans）、具核梭杆菌（fusobacterium nucleatum，F.nucleatum）、中间普氏菌（prevotella intermedia，P.intermedia）、福赛坦氏菌（tannerella forsythia，T.forsythia）、齿垢密螺旋体（treponema denticola，T.denticola）等。P.gingivalis已被确定为主要的牙周病原体之一，因此P.gingivalis最常用于牙周炎模型的建立。WANG等［24］向6周龄小鼠下颌磨牙的牙龈里接种P.gingivalis，2 d接种3次。12周后处死小鼠，结果发现与对照组比较，感染组小鼠出现明显骨丧失。牙龈局部接种牙周致病菌建立牙周炎模型优点是操作相对简单，建立小鼠牙周炎模型常采用此种方法，但单独使用可能比接种细菌联合结扎的方法效果略差［25］。

3 牙周炎和AS鼠类复合模型建立

目前研究显示，牙周炎与AS复合模型多采用两个及以上模型相结合的方法。

3.1 高脂饮食+腹腔注射维生素D3+磨牙结扎+口腔接种牙周致病菌复合模型

任秀云等［26］在SD大鼠腹腔注射维生素D3，并用高脂饲料喂养建立高脂血症模型，同时在鼠的第一、二磨牙上“8”字结扎丝线并接种P.gingivalis建立牙周炎模型。15周后，取大鼠动脉做病理检测，观察到动脉壁有钙盐沉积及泡沫细胞。随机检查大鼠口腔，发现有牙龈红肿、探诊出血、深牙周袋、牙齿松动等牙周炎表现。张源明等［27］在Wistar大鼠腹腔一次性注射维生素D3（70万IU/Kg），并用高脂饲料喂养建立AS模型，用3.0丝线结扎左右第二磨牙牙颈部，将密度为1×109CFU/mL的4种标准菌混悬液 （P.gingivalisATCC33277 菌株、A.actinomycetemcomitansATCC29523 菌株、F.nucleatumATCC25586 菌株、P.intermediaATCC25611 菌株） 接种于龈沟内，每3周接种1次建立牙周炎模型。12周后检查大鼠口腔可见牙龈红肿，深牙周袋形成。病理检查显示结合上皮向根部增殖，牙周炎动物模型建立成功。取大鼠动脉做病理检测，可见炎症细胞浸润，泡沫细胞聚集斑块形成，即AS模型建立成功。

3.2 基因敲除小鼠+口腔接种牙周致病菌复合模型

CHUKKAPALLI等［28］采用4种牙周致病菌 （P.gingivalis、T.denticola、T.forsythia和F.nucleatum，2.5×109/mL） 口腔灌洗ApoE-/-小鼠，24周时处死小鼠，结果发现与对照组比较牙槽骨吸收明显，动脉内膜明显斑块形成。F.nucleatum既可与早期定植菌共聚，又可与晚期定植菌共聚，可作为早晚期定植菌的黏结桥。因此CHUKKAPALLI等［29］模拟人口腔细菌定植的顺序，前12周在LDLr-/-小鼠口腔感染F.nucleatum（1×109/mL），后12周口腔感染P.gingivalis、T.denticola、T.forsythia混合菌 （5×109/mL）。每周4次，每3周1个感染周期，共持续8个感染周期。24周后处死小鼠，实验组可见牙槽骨明显吸收，动脉内膜可见斑块形成。

综上所述，鼠类模型虽然不能完美地模拟牙周炎或AS发病过程，但它是一种经济、快速、实用的动物模型。目前基因敲除小鼠已经在AS模型建立中普遍使用，但因其体型较小，磨牙结扎建立牙周炎模型仍有一定操作难度，开发基因敲除大鼠建立牙周炎和AS模型具有重大的意义。牙周炎作为AS的独立危险因素，其分子机制涉及较多炎性细胞因子和信号通路。希望今后能建立更有效的牙周炎和AS动物模型，以便进一步揭示牙周炎和AS之间作用的分子机制。