试验设计及其在中药新药研究中的应用

廖禹程 翁琰 石小鹏 孙莲 文爱东（通讯作者）

（1 空军军医大学第一附属医院药剂科 陕西 西安 710032）

（2 新疆医科大学药学院 新疆 乌鲁木齐 830011）

中药新药（new Chinese medicine）以中医理论为指导，以综合临床疗效为出发点，运用天然药物研究的基本原理和方法，开发和研究中药新药。开发中药新药，应注意了解临床需要、市场短缺或未饱和的药物，并根据临床需要选择剂型。同时，我们应该密切关注药物状况和政策法规。中药由于其独特的保健特点、毒副作用小、治疗费用低廉，非常适合在OTC市场销售。

1.正交试验设计与均匀试验设计

正交试验设计(Orthogonal exPerimental design)是基于正交性，从全面试验中选择一些有代表性的点。这些代表点具有“均匀分散，整齐可比”的特征，“均匀分散”只要通过这部分试验，就能反映全部全面试验情况，所以使试验点具有代表性。“整齐可比”可用数理统计方法对实验结果进行处理，在只考虑一个因素的影响时，其他因素的影响可以抵消。

正交试验法优点：

（1）试验点具有代表性，试验次数很少。

（2）可以在不重复测试的情况下估计实验误差。

（3）可以分清因素的主次。

（4）采用数理统计方法处理实验结果，提出预测条件。

正交试验法不足：

正交试验适用于水平数不多的实验。如果一项试验中有s个因素，每个因素各有q水平，并且通过正交试验来安排，则至少需要q²个试验。当q较大时，q²将更大，使实验者望而生畏。对这种类型的试验设计，均匀设计非常有用。

均匀设计又称均匀设计试验法（Uniform Design ExPerimentation），均匀设计就是只考虑试验点在试验范围内均匀散布的一种实验设计方法，也是通过一套精心设计的表来进行实验设计的。

均匀试验法的特点

（1）每个因素的每个水平都只进行一次试验，这大大降低了试验次数。

（2）任两个因素的试验点在平面的格子点上，每行每列有且仅有一个试验点。

（3）均匀设计表任两列组成的实验方案通常不相同，所以每个均匀设计表必须有一个附加的使用表

（4）随着因素的水平数增加，试验次数按水平数的增加量而增加。

（5）用计算机处理实验数据，方便、准确、快速地求解定量回归方程。分析各因素对实验结果的影响，可对优化条件进行定量预报及对实验结果区间估计进行优化。

试验设计结果分析

目的：选出各因素最佳水平以形成优选的实验方案。确定每个因素对指标影响的主要和次要关系。方法：对于正交试验结果，进行直观分析和方差分析。对于均匀设计结果，通常使用多元回归分析。将统计结果与生产实践相结合，进行综合分析，以确定最佳的提取工艺条件。最后，还应进行验证试验，无验证试验的优选结果没有价值。

正交设计应用举例：

正交试验法优选芪葛颗粒的提取工艺

（1）定因素：根据目的和文献调研，预实验确定为芪葛颗粒的加水量、提取时间和提取次数三个因素。

（2）划水平：分别选取加水量（8倍、10倍、12倍）提取时间（30min、60min、90min）提取次数（1次、2次、3次）三个水平。

（3）选正交表：采用L 9(3 4)正交设计

（4）横着做试验：因素位于表头，水平对号入座→试验，并记录试验效应的指标数值。

（5）数据处理：选择每个因素的最佳水平以形成优化的实验方案。确定每个因素对指标影响的主要和次要关系。方法有直观分析和方差分析。直观的结果表明，影响综合得分顺序大小的因素是：C(提取次数)＞A(加水量)＞B(提取时间)方差分析表明，只有煎煮次数对综合评分有显著影响，加水倍数和煎煮时间均无显著影响[17]。虽然提取时间对提取量没有明显影响，但黄芪甲苷和葛根素的提取量随提取时间的延长而降低。结合上述分析结果，最终提取工艺条件为：A3 B1 C3，即加入12倍水，提取3次，每次30 min[17]。

（6）验证试验：取3倍处方量药材3批，按最佳提取条件提取。结果显示黄芪甲苷的含量为0.590 mg.ml-1(n=3),葛根素的含量为8.248 mg.ml-1,(n=3)，表明各成分提取均较完全，且重复性良好，本研究确定的最佳提取工艺切实可行、可操作性强[17]。

正交试验法优选天麻提取工艺研究：

(1)定因素：根据目的和文献调研，预实验确定提取过程中乙醇浓度、溶媒用量、提取次数为三个因素。

(2）划水平：分别选取乙醇浓度（60%70%80%）溶媒用量（6倍8倍10倍）提取次数（2次3次4次）三个水平。

（3）选正交表：采用L 9(3 4)正交设计

（4）横着做试验：因素位于表头，水平对号入座→试验，并记录试验效应的指标数值，采用HPlC法测定天麻中天麻素含量。

（5）数据结果：天麻素在0.1428～0.7140μg(r＝0.9994)范围内线性关系良好，平均回收率为100.01%，RSD为1.04%[16]。结果显示，每种提取因素均对天麻素的提取率和提取出膏率有影响，乙醇浓度对天麻素提取率和天麻提取物出膏率的影响是主要因素，且对出膏率影响较显著，以60%乙醇提取效果最佳。综合考虑，最终选择6倍量60%乙醇回流提取2次，以获得最佳的天麻提取工艺[16]。

（6）验证试验：称取3份天麻药材，每份8.0 g，精密称定，并根据上述测定的天麻最佳提取工艺分别提取，并测定了天麻素的提取率和天麻提取物的出膏率[16]。工艺验证结果表明，通过本试验确定的提取工艺提取出的天麻素提取率较高、工艺稳定[16]。

均匀设计应用举例：

均匀试验设计优选干姜超临界萃取物微囊制备工艺：

（1）提取指标的测定：以载药量、包封率为指标。

（2）提取工艺的均匀试验设计：采用均匀设计对囊芯与囊材比例（x1）、进风温度(x2)、进液速度（x3）进行考察并进行综合评分。使用综合评分法，综合评分=载药量×100/最大载药量×权重0.8＋包封率×100/最大包封率×权重0.2，按照U 5(5 4)表安排试验，进行3因素5水平的均匀设计试验[11]。

（3）数据处理：得回归方程：Z=73.9905－7.5882χ1+0.1930χ2-1.3263χ3(P=0.024 8，r=0.999 2)，结果可信。在z值取最大时，χ1=1：1.1、χ2=159.5、χ3=7.5。综合生产情况，选择囊芯物和囊材比例为1：1.1，进风温度为160℃，进液速度为8 mL.min-¹[11]。

（4）验证试验：取处方量药材3份，分别优选工艺制备微囊，测定各指标并进行评价。得到的总得分在预测区间内，表明优选的工艺是稳定且可行的。

党参多糖提取工艺优化及不同购买地党参多糖含量比较：

（1）提取指标的测定：使用葡萄糖作为标准，根据标准曲线方程计算多糖的浓度。多糖提取率=多糖浓度×待测液体积／药材粉末质量[12]。

（2）提取工艺的均匀试验设计：采用U6(3×63)均匀试验设计，选择影响多糖提取较大的4个工艺参数，分别为温度、液料比、提取时间和超声功率，并比较10种不同购买地党参多糖含量[12]。

（3）数据处理：得多元回归方程为：y=0.338X4-0.002χ2×χ4－8.369.其中，χ1为提取温度，χ2为液料比，χ3为提取时间，χ4为功率.R2=0.963，结果显著(F=39.484，P=0.007)，说明回归模型有效[12]。从回归方程可以看出，提取功率对党参多糖提取率的影响最大，液料比与提取功率产生的交互作用次之，提取温度与提取时间在选定范围内对回归方程没有影响，为获取最高提取率使得X4最大选择135 W[12]。χ2×χ4最小即使得χ2为25，综上分析结合单因素结果得到最佳优化工艺为提取温度70℃，提取液料比为25：1，提取时间为35min，提取功率为135 W，预期多糖提取率为30.51%[12]。

（4）验证试验：分别以上述最佳工艺，提取多糖3次。提取率分别为31.86%，31.19%，30.74%，其平均得率为31.26%，相对误差为0.024，接近理论值，表明上述均匀设计结果的可靠性[12]。

2.讨论

试验设计越简单、无交叉，大生产可行性越大。所以，在制定试验设计时，应将实际情况考虑进去。使其具有可操作性，安全性大。同时，生产成本也是我们需要考虑的一个关键因素，减少一个操作单元或包装的成本，则可大大降低工业化生产成本。将各方面因素综合考虑，通过合理的试验设计制定更贴近实际生产的工艺路线。使中药新药的研究不仅仅是实验室研究，而真正能满足临床需要。

3.结语

综上，在中药新药的研究中，我们必然会遇到试验设计方案的确立和用数理统计方法处理数据的问题。在设计上，我们应该根据实验条件提前制定合理的试验设计方案。在数据处理上，切不可拿到数据再考虑统计方法。这样做无异于亡羊补牢，为时晚矣。合理的试验设计方法能帮助我们在实验时做到心中有数，节省时间，提高效率，结果可靠。在中药新药的研究中起到了至关重要的作用。