调节性T细胞在肺纤维化中作用的研究进展

王在强 傅恩清

肺纤维化是以成纤维细胞增殖、胶原蛋白沉积为特征的肺间质过度修复性疾病。微生物感染、粉尘接触、药物作用、射线照射、吸烟、遗传等因素都可导致肺纤维化[1-2]。尽管导致肺纤维化的因素很多，但它们可能存在共同的致病机制。长期或反复的细胞损伤启动了与免疫相关的损伤修复程序，造成异常激活的成纤维细胞不断增殖[3-5]。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)是胸腺来源的CD4+T细胞亚群，持续性表达IL-2受体α链CD25和转录因子Foxp3[6]。虽然Treg细胞只占健康成人CD4+T细胞的5%～10%，但可以下调机体对抗原的免疫应答，对维持免疫耐受十分重要[7]。人们对Treg细胞促进还是抑制肺纤维化存在较大分歧。Treg细胞可能通过抑制成纤维细胞的增殖直接抑制纤维化,通过抗炎作用和降低辅助性T细胞的反应间接抑制纤维化[8-9]。它也可能通过分泌促纤维化细胞因子如血小板源性生长因子B(platelet-derived growth factor-B, PDGF-B)和转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)促进纤维化[7]。肺纤维化中Treg细胞的数量，有人认为减少，有人认为增多[10-15]。反映出人们对Treg细胞在肺纤维化中的作用了解还不够深入。本文对Treg细胞在肺纤维化中作用的研究进展作一综述。

一、肺纤维化中不同亚型的Treg细胞数量和功能发生变化

根据细胞表型和功能的差异，将Treg细胞分为三种亚型：CD45RA-CD25+++激活型Treg细胞、CD45RA+CD25++静息型Treg细胞和CD45RA-CD25++分泌型Treg细胞[16]。激活型和静息型Treg细胞具有免疫抑制功能，几乎不分泌细胞因子。分泌型Treg细胞免疫抑制能力差，可大量分泌 IL-2、 IFN-γ和IL-17细胞因子。激活型Treg细胞绝大部分由静息型Treg细胞转化产生，是主要发挥免疫抑制作用的Treg细胞。静息型Treg细胞由胸腺生成，一旦静息型Treg细胞被激活，就可以通过增强FoxP3表达转化为激活型Treg细胞。

Hou等[17]对不同亚型的Treg细胞在特发性肺纤维化中的作用进行了研究，发现肺纤维化组与健康对照组外周血中Treg细胞总数相同，但肺纤维化组中静息型Treg细胞比例显著下降，激活型Treg细胞比例升高，分泌型Treg细胞比例没有变化。肺纤维化组支气管肺泡灌洗液中激活型Treg细胞的数量和比例显著增加。与外周血不同，分泌型Treg细胞在支气管肺泡灌洗液的比例增加。核蛋白Ki-67是反应细胞增殖能力的指标[16]。肺纤维化组与健康对照组相比，静息型Treg细胞表达Ki-67略微升高，而激活型Treg细胞表达Ki-67显著升高，表明肺纤维化组激活型Treg细胞的增殖能力比健康对照组增强。肺纤维化中激活型Treg细胞增多是免疫稳态被打破的标志，并且外周血激活型Treg细胞的比例与肺纤维化严重程度具有相关性[17]。

T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3, Tim-3)对Treg细胞发挥免疫抑制功能具有重要影响[18]。体外实验中，Tim-3+Treg细胞的抑制作用强于Tim-3-Treg细胞[19]。在急性肺损伤患者的外周血中，Treg细胞数量和Tim-3在Treg细胞中的表达都显著提高[20]。Tim-3+Treg细胞能够减少中性粒细胞的聚集并促进其凋亡，降低胶原蛋白的表达和含量，从而抑制肺损伤后的肺部炎症和纤维细胞增殖，但Tim-3-Treg细胞没有这种功能[21]。

二、Treg细胞分泌促纤维化细胞因子可能不是肺纤维化中胶原蛋白沉积的主要原因

Lo等[7]发现敲除Treg细胞的肺纤维化小鼠与未敲除Treg细胞的肺纤维化小鼠相比，支气管肺泡灌洗液中TGF-β和PDGF-B水平降低，但胶原蛋白含量相同。敲除Treg细胞的肺纤维化小鼠，可以通过CD4+效应T细胞分泌IL-4等细胞因子促进成纤维细胞增殖。促进作用与CD4+效应T细胞数量呈正比，而且促进纤维化的作用，只有在Treg细胞缺失时才能表现出来。Birjandi等[22]发现注射IL-2复合物的肺纤维化组与未注射IL-2复合物的肺纤维化组相比，肺组织中1型细胞因子IL-18含量显著减少，Treg细胞数量、胶原蛋白和2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)显著增加，但两组间TGF-β和PDGF-B水平无差异。TGF-β和PDGF-B是Treg细胞重要的促纤维化细胞因子，在肺纤维化中Treg细胞数和胶原蛋白含量明显上升的情况下，两者均没有升高。即使在Treg细胞被敲除了的情况下，肺纤维化中胶原蛋白含量依然没有变化。以上两点都提示Treg细胞分泌TGF-β和PDGF-B可能不是导致肺纤维化的主要途径，提示还存在导致肺纤维化中胶原蛋白沉积的其他更重要的途径。

三、Treg细胞表型发生改变，抑制功能丧失，促进了肺纤维化

Treg细胞具有很强的可塑性。Zhou等[23]认为局部微环境以提供特定的细胞因子和/或细胞-细胞(或细胞-微生物)相互作用的方式，决定Foxp3+细胞的转化方向。Voo等[24]发现外周免疫系统的Treg细胞可以改变表型和功能。黏膜发炎时，外周血和淋巴组织中表达趋化因子受体6(chemokine receptors 6, CCR6)的Treg细胞可以转化为Th17细胞并分泌IL-17。鲍文华等[25]发现大鼠肺纤维化组中Th17细胞数量明显增多，并且Th17细胞数与CCR6呈正相关，说明Th17细胞可能通过与CCR6相互作用参与肺纤维化发病过程。Foxp3持续表达是Treg细胞发挥抑制作用的基础[26]。Zhou等[27]发现Treg细胞可以失去表达Foxp3、CTLA-4和CD25的能力，产生IL-2和IFN-γ等炎性细胞因子，丧失免疫抑制功能。Birjandi等[22]将Treg细胞转入Rag1-/-小鼠并用博来霉素诱导肺纤维化，Treg细胞的数量显著减少并且表型改变，CD25和Foxp3的表达显著减少。Bian等[28]发现矽肺患者Treg细胞数量增多，但是表达Foxp3的Treg细胞仅占CD4+CD25+T细胞的一小部分，其他Treg细胞表现出Th1和Th17细胞的表型，干扰素和IL-17表达升高而Foxp3和TGF-β表达降低，且Treg细胞抑制CD4+效应T细胞增殖的能力显著下降。Treg细胞和Th17细胞关系密切，它们各自的特异性转录因子FoxP3和 RORγT都是TGFβ信号通路的下游靶点[29]。Raijmakers等[30]发现，正常Treg细胞与CD25+FoxP3+RORγT+IL-17A+促炎性Treg细胞可以相互转化，Toll样受体2(Toll-like receptor 2, TLR2)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)在两者间的转化中发挥了重要作用。TLR2和CTLA-4表达减少促进正常Treg细胞向促炎性Treg细胞转化。正常Treg细胞可有效抑制Th17细胞，但当正常Treg细胞转化为促炎性Treg细胞时，就会丧失抑制作用。有研究表明，使用抗CTLA-4抗体的患者，结节样肉芽肿性的发病率和严重程度都升高[31-32]，CTLA-4表达减少会降低Treg细胞对T细胞的调控能力[33]。还有研究表明，IL-17+ Treg仍具有抑制功能，只是在IL-1β和IL-6等炎性因子存在的情况下下才会丧失抑制能力[34]。在肺纤维化的微环境中，Treg细胞表型发生变化，免疫抑制功能即使没有完全丧失，也有很大程度的下降。干扰素γ(interferon Type Ⅱ, IFN-γ)和 IL-4能够抑制Foxp3在Treg细胞中的表达，而CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhance-binding protein, C/EBP)可以解除这种抑制作用，促进Treg细胞的生成并增强其免疫抑制功能[35]。因此，C/EBP可能在维持Treg细胞正常表型中发挥了重要作用。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, AdSCs)能够减轻博来霉素诱导的肺纤维化，抑制 Th2型CD4+T细胞分化增殖，促进Treg细胞的分化增殖，改变T淋巴细胞的亚型可能是脂肪干细胞抑制肺纤维化中炎症反应的机制之一[36]。CD4+CD25-效应T细胞在某些调节下也可以转变为Treg细胞[37-39]。产生IL-10的调节性B细胞(IL-10-producing regulatory B cell, B10) 可以增强Treg细胞功能，促进效应T细胞转化为Treg细胞[40-42]。减少B10数量可以抑制Foxp3的表达，导致Foxp3+ Treg的数量降低，减轻肺纤维化[43]。

四、提高肺纤维化中Treg细胞的数量可能会加重肺纤维化

Birjandi等[22]通过IL-2复合物扩增肺纤维化中的Treg细胞，加重了肺纤维化。咪唑硫嘌呤可以提高Treg细胞数量，但硫唑嘌呤治疗特发性肺纤维化的多中心临床试验显示，使用硫唑嘌呤后，肺纤维化患者的住院次数和病死率增加[44-45]。在Treg细胞数量增加促进肺纤维化方面，两者观点相一致。

在博来霉素诱导的肺纤维化中，Birjandi等[22]认为是博来霉素直接诱导了Treg细胞表型的改变。Raijmakers等[30]发现曲霉菌本身不能抑制CTLA-4的表达，认为是曲霉菌诱导机体产生了正常Treg细胞向促炎性Treg转化所需要的炎症介质。我们认为不是博来霉素直接诱导了Treg细胞表型的改变，而是博来霉素导致肺损伤后，机体产生了能够诱导Treg细胞表型变化的微环境。在该微环境下，Treg细胞表型改变，转化为促炎性Treg，抑制功能丧失，失去了对CD4+效应T细胞的抑制作用，造成CD4+效应T细胞大量增殖，进而成纤维细胞增殖和胶原蛋白沉积，促进了肺纤维化。这符合不同损伤因素都能导致肺纤维化的事实。因此，在不改变肺内微环境的情况下，即使增加Treg细胞的数目，Treg细胞也可能会在微环境下改变表型，丧失功能，不能对CD4+效应T细胞发挥抑制作用，而且会转变为促炎性T细胞，加重肺纤维化。 Zhou等[23]也认为，当肺纤维化微环境已经建立的情况下，Treg细胞治疗肺纤维化可能无效甚至有害，因为Treg细胞会在此微环境下改变表型和功能。在博来霉素诱导小鼠肺纤维化后的第14天，过继转移Treg细胞可以显著减轻肺纤维化，但研究者没有对肺纤维化晚期过继转移Treg的效果进行研究[46]。研究发现在矽肺模型中，于造模第4周经鼠尾静脉输入间充质干细胞，肺纤维化程度比对照组降低[47]。Liu等[48]进一步发现使用间充质干细胞治疗放射性肺损伤时，在急性期(照射后6 h)使用要比在后期(照射后28 d)使用减轻炎症和抑制纤维化的效果更好。因此，在肺损伤(injuvy of lungs)后肺微环境改变前进行干预，对抑制肺纤维化的发生发展十分重要，一旦导致肺纤维化的微环境形成，肺纤维化过程将很难纠正。研究表明，通过抗CD25单抗在肺纤维化早期去除Treg细胞减轻纤维化，而在肺纤维化晚期去除Treg细胞则加重纤维化，因此认为Treg细胞在小鼠肺纤维化的早期起促进纤维化作用，但在肺纤维化的晚期起抑制纤维化作用[49]。我们不认为是一种细胞在疾病不同阶段发挥了相反的作用，可能性更大的是在肺纤维化晚期，使用抗CD25单抗去除了残存的还能够正常发挥抑制功能的Treg细胞，因此会加重肺纤维化。在肺纤维化早期，抗CD25单抗抑制了Treg细胞的生成，减少了后期转化为促炎性Treg细胞的数量，因此减轻了肺纤维化。

综上所述， 肺纤维化中不同亚型的Treg细胞数量发生变化，而且这种变化与肺纤维化严重程度有相关性。因此，可以将不同亚型Treg细胞数量作为判断肺纤维化患者预后的指标，把恢复Treg细胞亚型间的平衡作为治疗肺纤维化的备选方案[17]。不同亚型的Treg细胞都表达CD25，因此CD25不适合作为筛选不同亚型Treg细胞的标志分子，要进一步寻找不同亚型Treg细胞的特异性标志分子，以便对不同亚型Treg细胞进行分类研究。Treg细胞表型在肺纤维化中发生变化，由具有免疫抑制作用的细胞转变为促炎性细胞，解释了肺纤维化中Treg细胞和炎性细胞因子同时增多的现象，阻断Treg细胞表型改变和恢复Treg细胞的表型可能成为预防和治疗肺纤维化的新方案。当前，对肺纤维化中不同亚型Treg细胞数量和功能改变的机制还不了解。在肺纤维化微环境中，促炎性Treg细胞是Treg细胞转变的终末细胞，还是会进一步向Th2和/或Th17细胞转化仍不明确。尤为重要的是，肺损伤后微环境诱导Treg细胞表型改变的机制尚不清楚，Treg细胞表型和功能改变究尽是肺纤维化的始动因素还是存在上游的调控作用，已成为当前亟待解答的问题。