碱预处理对固体碳源生物可利用性及其强化生物脱氮效能的影响❋

马雨阳， 纪鸿飞， 孙昭玥， 郑西来,3❋❋， 辛 佳,3

(1.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100； 2.中国科学院南京土壤研究所，江苏 南京 210008； 3. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛266100)

地下水硝酸盐污染问题日益严重，除了农业施肥、污水灌溉等导致的面源污染外，化粪池、生活垃圾堆放处、农家肥储存地等集中点源也是地下水硝酸盐污染的重要来源[1-2]。在包气带构建脱氮层是阻控硝酸盐向地下水运移的一种有效措施，包气带能够为其中广泛存在的反硝化细菌创造天然的厌氧环境，因此高效低耗的反硝化生物脱氮有很大的应用潜力。然而生物可利用的碳源不足，会制约反硝化脱氮效率[3]。国内外学者多采用添加木质纤维素类物质如木屑、稻草等固体碳源的方法来提高反硝化脱氮效果[4-5]，这些物质来源广泛而且价格低廉。但是在实际应用中，直接以纤维素类物质作为外加碳源时，由于其具有结构复杂、性质稳定等顽抗特性，后期生物可利用性降低，导致脱氮效果较差[6]。例如，Schipper等[7]在表层土以下安装添加花木碎屑的脱氮层来处理乳制品厂的废水，由于硝酸盐停留时间较短，后期碳源可利用性下降，无法显著减少硝酸盐的下渗。针对这一问题，可考虑对纤维素类物质进行预处理来解决。此前，各种木质生物质预处理技术多应用于生物燃料领域[8]，仅有少量研究关注预处理后生物质作为固体碳源的促反硝化效果。马玉霞等[5]研究发现，用Ca(OH)2对水稻、小麦、玉米和高粱4 种典型农作物的秸秆进行预处理，经过处理的秸秆酶解产糖量较高，作为固体碳源的反硝化速率大大提高。此外，之前的研究多依托批量试验体系开展，不能真实反映实际脱氮层在运行过程中的作用效能。

本研究采用易于获取、价格低廉的弱碱Ca(OH)2对玉米芯和麦秸进行预处理，以酶解还原糖产量来表征固体碳源的生物可利用性[9]，考察Ca(OH)2投加量、处理温度和处理时间对碳源酶解产糖量的影响，优化碱处理条件。依托优选出的外加碳源，在室内模拟构建强化脱氮层，通过对出水pH、硝态氮、亚硝态氮含量等进行监测，考察脱氮层中添加的碳源种类、粒径及膨润土含量对脱氮效能的影响，为构建稳定且高效的脱氮层提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米芯和麦秸均收集于山东省莱西市。试验用土样取自山东省莱西市店埠镇大田，取样深度在地表以下20～50 cm，土壤成土母质为冲积和冲洪积层，属于砂质壤土，自然风干到田间持水量的45%，然后过2 mm筛备用。石英砂过筛保留0.5～1 mm粒级部分，洗净，烘干备用。膨润土为人工改性的钠基膨润土，在蒸馏水中的膨胀比为20，购买自河南省巩义市夹津口龙跃滤材经销部。

1.2 方法

1.2.1 碳源材料的预处理 将玉米芯和麦秸水洗、60 ℃烘干，粉碎后过筛，取用0.18～0.7 mm(24～80目)粒径部分的原料，再次水洗、烘干，作为预处理的原材料备用。往150 mL的具塞锥形瓶中分别加入5 g的玉米芯和麦秸，然后分别加入50 mL(玉米芯)和75 mL(麦秸)的蒸馏水，最后加入一定量的Ca(OH)2。将具塞锥形瓶置于摇床中油浴，控制转速为150 r/min，并设置一定的温度和反应时间，然后对处理后的碳材料进行抽滤，用水冲洗至滤液的pH值为7.0～7.5，60 ℃下烘干，最后测定处理后的碳材料质量并密封保存备用。每种处理均进行三组平行试验。具体试验条件设置如表1所示。

表1 碱处理试验设计Table 1 Design of alkali treatment experiment

1.2.2 酶解产糖量的测定 以酶解产糖量来表征预处理前后固体碳源的生物可利用性。称取碳材料(24～80目)1.0 g于50 mL的离心管中，分别加入10 FPU/g干物质纤维素酶和20 CBU/g干物质的β-葡萄糖苷酶，用醋酸钠缓冲溶液调节反应体系的pH值为4.8，然后加入0.03%的叠氮化钠。将离心管置于恒温摇床中，设定转速和温度分别为100 r/min和50℃，培养3天后离心，取出上清液过滤，最后用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法测定滤液中还原糖含量。纤维素酶和β-葡萄糖苷酶均购于江苏锐阳生物科技有限公司，纤维素酶酶活为48.6 FPU/g，β-糖苷酶酶活为826.0 CBU/g。

1.2.3 碳源材料生物质组分的测定 碳材料(24～80目)的木质素、半纤维素、纤维素、丙酮抽提物以及灰分含量根据Lin等[10]和Ayeni等[11]的方法进行测定。

1.2.4 脱氮反应层的构建 强化脱氮反应层的实验模拟装置主要包括供水装置、渗滤土柱和集水容器。供水装置由储水箱、潜水泵、供水箱和流量调节阀组成，进行定流量供水。渗滤反应器为直径10 cm高50 cm的PVC柱，PVC柱下部设有出水口，试验装置如图1所示。

(1-储水箱，2-潜水泵，3-供水箱，4-流量调节阀，5-布水层， 6-脱氮层，7-集水层，8-集水容器。1-Water tank,2-Submerged pump,3-Feed tank,4-Flow control valve, 5-Distribution water layer,6-Denitrification layer,7-Catchment layer,8-Catchmentvessel.)

图1 试验装置示意图
Fig.1 Schematic diagram of experimental set-up

脱氮层土柱由下至上依次装填，最下层是集水层，由5 cm厚的石英砂组成(粒径为0.5～1.0 mm，容重为1.55 g/cm3)；中间层是20 cm厚的脱氮层(1.01 g/cm3等容重填充)；最上层为布水层，填充材料及厚度与最下层集水层相同。用200目的不锈钢筛网将反应层与布水层和集水层分隔。通过调整脱氮层的填充介质配比，共构建4组不同的生物脱氮反应层，研究碳源种类、粒径及膨润土含量对脱氮层效果的影响。脱氮层填充的材料及组成如表2所示，其中2 mm和0.5～1.5 mm玉米芯的预处理方式同1.2.1。将各种介质按比例称量、均匀混合后，以等容重1.01 g/cm3装入PVC柱中。

表2 脱氮层的构成Table 2 The composition of denitrification layer

2 结果与讨论

2.1 预处理工艺优化

2.1.1 温度对碳源生物可利用性的影响 添加0.1 g Ca(OH)2/g干物质，反应时间为24 h，考察温度对碳材料的酶解还原糖产量的影响，结果如图2所示。结果表明，未进行预处理的玉米芯和麦秸的酶解还原糖产量分别为191.3和86.4 mg/g干物质，经过不同温度的碱处理之后，玉米芯和麦秸的酶解产糖量相比原材料提高了1.6～2.1倍和3.1～3.5倍。由图2可以看出，随着温度的升高，玉米芯的还原糖产量呈现先逐渐上升然后略有下降的趋势。而麦秸的酶解产糖量随温度的升高变化不明显。在70 ℃的处理温度下，玉米芯的还原糖产量最高，可达到593 mg/g干物质，麦秸还原糖产量最高是在95 ℃，可达389 mg/g干物质。因此，玉米芯和麦秸Ca(OH)2预处理的最佳温度分别为70和95 ℃。

图2 处理温度对固体碳源还原糖产量的影响Fig.2 Influence of treatment temperature on reducing sugar yield of solid carbon source

2.1.2 预处理时间对碳源生物可利用性的影响 预处理时间也是影响碳材料生物可利用性的重要因素之一，添加0.1g Ca(OH)2/g干物质，控制反应温度95 ℃，分析不同处理时间对碳材料可生化性的影响，碳材料酶解还原糖产量随处理时间的变化如图3所示。分析结果发现，碱处理时间的改变对玉米芯和麦秸酶解性能的影响不大。延长处理时间，玉米芯和麦秸的还原糖产量先略有上升然后逐渐下降至稍低的水平。这是由于碱不仅会使碳材料中的木质素结构被破坏，同时也会释放出部分易溶解的半纤维素。因此，碱处理时间过长易导致碳材料中溶解性有机碳的释放，不仅不能提高碳源的酶解性能，反而会使碳材料中可利用碳的数量减少。由图3可知，玉米芯和麦秸的最优预处理时间分别为6和24 h，酶解还原糖达到最大值分别为611和389 mg/g干物质，比原材料提高了2.2和3.5倍。

图3 处理时间对固体碳源还原糖产量的影响Fig.3 Influence of treatment time on reducing sugar yield of solid carbon source

2.1.3 Ca(OH)2添加量对碳源生物可利用性的影响 通过以上研究可以知道，玉米芯碳源在处理温度为70 ℃，处理时间为6 h时酶解产糖量达到最大，而麦秸在95 ℃和24 h处理条件下还原糖产量才达到最大。因此，控制玉米芯和麦秸预处理条件分别为70 ℃、6 h和95 ℃、24 h，研究Ca(OH)2添加量对碳材料酶解产糖量的影响，结果如图4所示。研究发现，随着Ca(OH)2投加量的增加，玉米芯和麦秸的酶解产糖量逐渐增加然后趋于稳定。Ca(OH)2投加量为0.1 g/g干物质时，玉米芯和麦秸的酶解产糖量分别达到最大值657.1和370.15 mg C6H12O6/g干物质。继续增大Ca(OH)2投加量，碳材料的还原糖产量没有明显提高。

综合以上三组结果可以知道，碳源预处理的最佳条件为：添加0.1 g Ca(OH)2/g干物质、在70 ℃下处理玉米芯6 h；添加0.1 g Ca(OH)2/g干物质、在95 ℃下处理麦秸24 h。在最优条件下处理的玉米芯和麦秸，酶解产糖量分别提高了2.4和3.3倍。无论碱处理前或后，

玉米芯相比麦秸都具有更高的生物可利用性。因此选择玉米芯作为强化脱氮层的外加碳源。

图4 Ca(OH)2投加量对碳源还原糖产量的影响Fig.4 Influence of dosage of Ca(OH)2 on reducing sugar yield of solid carbon source

2.1.4 碳材料碱解质量损失与其生物可利用性的相关分析 在上述最优条件下对碳源材料进行预处理，分析其处理前后的物质组成，结合组分变化来分析碱解质量损失与碳源生物可利用性之间的关系。对不同碱处理条件下玉米芯和麦秸的质量损失和酶解还原糖产量进行线性相关分析，结果如图5所示。石灰处理后玉米芯的碱解质量损失和还原糖产量呈显著相关(R2=0.83，P<0.001)，麦秸也存在相似的正相关关系(R2=0.59，P<0.001)。玉米芯和麦秸碳源材料的物质组成如表3所示。

表3 碳源材料的化学组成Table 3 The chemical composition of carbon source /%

(a、b分别表示玉米芯和麦秸。a, b represent corncob and wheat straw respectively.)

玉米芯和麦秸的碱解质量损失和还原糖产量间的正线性相关关系主要与碱处理后碳材料的可及表面积、木质素半纤维素含量等的变化有关。目前文献报道的碱预处理方法都能在一定程度上提高木质纤维素的可及表面积[6]。同时，本研究中碱处理以后碳源材料的质量有一定程度的下降，也间接表明了预处理通过在材料中产生多孔结构导致可及表面积的增加，从而有利于酶解[12]。经过预处理以后，玉米芯和麦秸都有碱解质量损失，其中的木质素含量分别降低了1.44%和1.31%，半纤维素含量则分别降低了9.3%和17.37%，纤维素含量显著增加(见表3)。由此可得，碱处理会溶解部分木质素和半纤维素，半纤维素的水解会导致木质纤维素结构发生变化，增加酶对纤维素和半纤维素的可及性，进而提高酶解还原糖的产量[13]，也有研究直观证明了半纤维素含量的减少有利于底物对纤维素酶的吸附[14]，因此酶解还原糖产量也和木质素半纤维素含量变化有关。

2.2 脱氮反应层的运行效能

2.2.1 渗透速率的动态变化 研究表明，在人工湿地、地下水渗透反应墙和相关的土地处理系统中，影响反应介质使用寿命的关键因素之一就是堵塞[15]。堵塞是所有高负荷污水过滤系统中常见的自然效应，适度的介质堵塞可以增大脱氮层处理系统内部的非饱和流动区域，提高系统的处理效果；而过度的堵塞会使脱氮层的水力性能变差，污水不能得到有效处理，最终影响到处理系统的处理效率和使用寿命[16]。通过对脱氮层渗透出水速率的连续监测，考察整个反应期内各脱氮层渗透性能的变化，这对优化脱氮层的设计，提高脱氮层使用寿命具有重要意义。

不同脱氮层土柱的渗滤出水速率随时间的变化曲线如图6所示。可以看出，反应运行的初始进水流量为(50±5) mm/d，脱氮层运行的第一周内，A、B、C脱氮层的渗透速率缓慢下降至(35±5) mm/d，而D层的渗透速率不规律地降低至28 mm/d。在第9天用真空泵从每个脱氮层的出水口进行排气，排除反硝化产生的气体。在排气之后，出水速率明显提高至初始进水的水平，随后又呈现缓慢下降趋势，然后出水速率趋于稳定至结束。D脱氮层在整个运行周期内渗透出水速率都低于A、B、C层，至脱氮层运行结束时，A、B、C、D层渗透速率分别下降至19、10、17和8 mm/d。分析可以得出，添加了膨润土的D脱氮层与未添加的相比出水速率更低，较容易出现堵塞问题。C层相比B层采用较大粒径填料能够在一定程度上提高出水速率，降低了堵塞发生的概率。在第9天对脱氮层土柱进行排气处理，破坏了反硝化产生的气阻，使排气之后的出水速度增加，这说明造成脱氮层渗透性下降的原因除了已有研究指出的微生物堵塞[15]以外，气体堵塞也是导致脱氮层渗透性能下降的原因之一。在脱氮层运行后期，D层发生积水并在出水口处出现断断续续的成股水流，其他层未出现。当脱氮层渗透性下降至一定程度会造成填料表面产生积水，诱发短流或绕流[16]，水体有效停留时间缩短，使微生物无法充分降解污水中的污染物[17]。排气处理可以较大程度的恢复脱氮层的渗透性，因此，调节脱氮反应层的渗透性能，对于保证反硝化效果，延长脱氮层使用寿命十分必要。

2.2.2 出水pH的变化 pH值是影响生物生长繁殖的主要环境因素之一，对于反硝化微生物而言，适宜的pH值为5.5～8.0[18]。在脱氮反应层运行过程中，进出水的pH随时间的变化如图7所示。在整个脱氮层运行过程中，pH虽然有升降，但一直保持在适宜反硝化微生物活动的范围内，这为反硝化的进行提供了有利的环境条件。在反应的前7天，进水的pH较为稳定，而A、B、C脱氮层系统出水pH逐渐降低，这可能因为纤维素在微生物作用下分解，产生乳酸和乙酸等小分子的有机酸[19]，从而使出水pH不断下降。当少量纤维素被分解时，细菌自身在不断消耗有机酸等分解产物，而反硝化过程中产生的碱性物质也逐渐中和纤维素分解所产生的酸度[19]，使pH升高，因此脱氮层A、B、C、D运行大约一周以后，出水的pH值由原来的下降变为缓慢上升，而后趋于稳定。综上，脱氮层内部的各种反应对pH 值起到了一定的调节作用，使脱氮层的pH较为稳定。

图6 脱氮层渗透速率随时间的变化曲线Fig.6 Change of seepage velocity of denitrification layer according to time

图7 脱氮层出水pH随时间的变化曲线Fig.7 Change of pH of denitrification layer percolate according to time

2.2.3 脱氮层对硝酸盐的去除效果 考察不同脱氮层对硝态氮去除效果的影响，结果如图8所示，可以看出，在反应层运行初期，添加碱处理玉米芯的脱氮层(B、C、D层)在第2天对硝酸盐的去除率就达到60%左右，而脱氮层A达到相同的去除效果需要10天以上。由此可以得出，添加碱处理玉米芯的脱氮层启动速度快，这与碳源的可利用性高有着密切的关系[20]。在脱氮层的整个运行阶段，与添加玉米芯原材料的脱氮层相比，以碱处理玉米芯作为碳源的脱氮层有更高的硝酸盐去除率，去除率可达到80%～97%，而玉米芯原料脱氮层只能去除60%左右的硝态氮。因此，碱石灰处理生物质材料用作碳源，可有效提高脱氮层的硝酸盐去除率。

(a、b、c和d分别表示脱氮层A、B、C和D。a, b, c and d represent denitrification layer A, B, C and D respectively.)

图9 脱氮层渗滤液中亚硝态氮浓度变化Fig.9 Change of concentration of nitrite nitrogen of denitrification layer percolate

3 结论

(2)无论碱处理前后，玉米芯相比麦秸都具有更高的生物可利用性，因此选用玉米芯作为外加碳源构建强化脱氮层。玉米芯构建的脱氮层具有稳定pH值的能力，使其一直保持在反硝化适宜的范围内。

(3)未处理玉米芯构建的脱氮层只能去除60%～67%的硝态氮，而小粒径碱处理玉米芯(24～50目)构建的脱氮层效能最好，硝酸盐去除率稳定在90%以上，且启动后不会出现亚硝酸盐积累现象。适当添加膨润土能够通过降低渗透性来延长硝酸盐在脱氮层中的停留时间，提高脱氮层处理效果。