液态活检在非小细胞肺癌靶向治疗中的研究进展

赵玲, 易善永, 闫晓倩, 郜辉

近年来,分子靶向治疗在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的综合治疗中占极重要的地位,肿瘤个体生物学特性的差异是个体化治疗的基础,比如针对在NSCLC中检测到的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、棘皮动物微管相关类蛋白4-间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein-llike 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)和ROS1(repressor of silencing 1)等基因的个体化治疗[1-3],为肺癌的治疗掀开了新的篇章。目前临床上针对肺癌的靶向治疗药物主要有表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)和作用于EML4-ALK、ROS1靶点的克唑替尼。研究证明,EGFR突变及ALK基因融合表达的患者接受相应靶向治疗的疗效优于含铂的两药化疗方案,然而在靶向治疗过程中,一些突变耐药基因的出现会直接导致治疗的失败,如T790M突变[2];因此,在治疗前了解基因突变的状态,以及在治疗过程中实时动态检测耐药基因的出现对NSCLC的个体化治疗尤为重要。

临床上最常用的肺癌基因检测标本是组织学标本,但只有约30%的患者能够获取足够的组织标本进行检测。取材不方便、开展实时活检很难被患者接受,尤其是身体状况较差的患者。而液态活检是对肿瘤患者的体液进行检测,主要是通过检测肿瘤细胞释放到体液中的标志物信息来获得患者体内肿瘤基因或蛋白表达的信息。液态活检的主要检测标本是血液、尿液和唾液等[4-5]。目前临床上通过血液检测的主要有循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)、肿瘤衍生外泌体(tumor-derived txosomes, TEXs)、循环肿瘤RNA(circulating tumor RNA, ctRNA)、血浆蛋白和代谢物等[6-7],而临床上最常检测的是ctDNA、CTCs和TEXs。液态活检是一种非侵入性的检测方法,取材方便,容易被患者接受,成为目前临床上最有应用前景的肿瘤组织标本替代品;现将液态活检技术在NSCLC分子靶向治疗中的研究进展综述如下。

1 ctDNA

1.1 ctDNA的概述 1948年,Mandel和Métais发现人的外周血中可检测到循环游离DNA。1977年,研究人员在肿瘤患者体内发现了循环肿瘤DNA的存在;1994年,在肿瘤患者的外周血中检测到了癌基因RAS的变异,表明部分循环DNA来自于肿瘤。ctDNA主要有3个来源:凋亡和坏死的肿瘤细胞、CTCs和TEXs[8-9]。研究证实在多种肿瘤患者的外周血中检测到ctDNA,它与肿瘤组织的DNA具有高度的一致性,并且其浓度与肿瘤的大小、分期呈正相关[8-10]。此外,ctDNA的检测也能辅助对肺癌的诊断与分期,并可指导肺癌的个体化用药及对耐药性的分析。

1.2 ctDNA的检测方法 由于来自正常组织的DNA含量较高,而细胞游离DNA只是其中的一小部分,因此获得和分析ctDNA要比CTCs难度更大。目前,ctDNA的检测方法主要包括:突变扩增系统(amplification refractory mutation system, ARMS)、二代测序(next generation sequencing, NGS)和微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)。以ddPCR和NGS为基础的DNA突变检测技术日趋发展成熟。ddPCR技术已普遍用于检测靶向DNA突变,虽然基于PCR的技术具有很高的灵敏度,可用于监测低至0.01%的肿瘤相关基因突变,但该技术只能检测有限数量的病灶[11-12]。因此,ddPCR技术在监测过程中可能会遗漏大量信息。NGS技术能更全面的获得整个基因组区域的信息,它提供了个体化癌症基因图谱的特征和开发个体化医学的机会。在越来越多的驱动程序突变测试的背景下,NGS表现出了更多的优势,因为它可以更高效的同时检测多个基因的突变。Rothé等[8]首先在晚期乳腺癌患者中进行了深入覆盖的NGS检测,检测了50个基因热点区域的突变,并在24%的患者中发现了原发肿瘤的DNA与血浆之间的不一致突变。但由于其成本较高,尤其是数据管理的复杂性,该技术的临床应用受到了一定的限制。相信在不久的将来,随着基因组技术和生物信息学灵敏度的不断提高,NGS技术能够在ctDNA分析应用中发挥核心作用。

1.3 ctDNA在肺癌靶向治疗中的应用 ctDNA在肿瘤的诊断、肿瘤分子异质性、肿瘤动态变化的监测、寻找靶点、疗效评价和预后评估等方面具有重要的价值。2015年欧洲肺癌年会公布了IGNITE研究结果[9],该研究检测了2 581例NSCLC患者的组织学或细胞学标本与ctDNA标本的EGFR突变率,结果显示,ctDNA标本和组织学或细胞学标本检测具有很高的一致性,且ctDNA具有较高的特异性,在亚太地区的患者中可以达到97.2%。Luo等[10]对20项研究进行Meta分析发现,采用ctDNA与肿瘤组织活检对EGFR进行检测具有同样的诊断准确性。Qiu等[13]对27项相关研究进行Meta分析也发现,ctDNA检测的总敏感度为62%,特异度为96%。存在驱动基因突变的NSCLC患者可以接受相应的靶向治疗,但目前的靶向治疗药物,无论是EGFR-TKI还是ALK抑制剂均会在1年左右出现耐药,对EGFR-TKI药物敏感的患者,当出现病情进展时,约40%～60%的患者存在T790M突变。近期的一项研究通过组织标本检测到T790M突变率为47%,通过液态活检(CTCs、ctDNA)检测到突变率为50%,具有很高的检测一致性[14]。而对于这部分患者耐药性的准确判定,实体瘤疗效评价标准(RECIST)可能并不完全适用。所以通过液态活检获得耐药基因的表达情况成了目前研究的重点方向之一。Sorensen等[15]采用PCR技术检测23例进展期NSCLC患者的血浆EGFR表达情况,发现EGFR突变患者对厄洛替尼有42种不同的敏感性表达,在厄洛替尼应用前后均进行检测,结果显示96%的患者在治疗开始阶段L858R突变或19外显子缺失呈下降趋势,没有检测到T790M突变,但随着治疗的进行,39%的患者出现了T790M突变,因此,对T790M的持续监测能够较早发现肺癌患者的进展;对T790M突变阳性的NSCLC患者临床上可应用第三代TKIs靶向治疗。2015年发表在Nature Medicine杂志上的关于三代EGFR-TKIs耐药机制的研究对15例T790M突变的患者给予AZD9291治疗,随访并动态监测ctDNA的变化,发现并证实了AZD9291获得性耐药的突变位点C797S[16]。AZD9291存在3种耐药模式,一种是耐药后T790M突变与C797S突变同时存在,另一种是耐药后仅出现T790M的再次升高,第三种是耐药后既不伴有T790M也无C797S的出现[15-16]。液态活检可用于肺癌靶向治疗效果及预后的预测。Imamura等[17]对52例EGFR突变阳性且首次给予EGFR-TKI治疗的NSCLC患者治疗期间进行血液EGFR突变检测,同时采用CT扫描与RECIST标准评价疗效,结果显示患者血浆ctDNA水平与RECIST评价结果相吻合,表明ctDNA检测可评价EGFR-TKI治疗效果。Yang等[18]对73例晚期肺腺癌患者行EGFR-TKI治疗前后的血浆样本进行ctDNA检测,结果显示74%的样本检测到了EGFR突变,EGFR突变阳性患者比野生型患者的预后更好,且EGFR高突变丰度(>5.15%)的患者相比于低突变丰度(≤5.15%)患者呈现了更好的预后。近年来,有研究表明可以通过ctDNA检测肺癌免疫抑制剂疗效的分子标记物如肿瘤突变负荷(tumor mutation burden, TMB)。Gandara等[19]研究发现通过检测血液样本中的TMB(bTMB)可以很好的预测患者能否从PD-L1抗体治疗中获益。研究人员先对两个临床队列的bTMB与组织样本的TMB(tTMB)进行比较,确定了在整体上tTMB与bTMB确实呈正相关的关系,表明bTMB确实能够作为免疫治疗的潜在非侵入性生物标志物。

2 CTCs

2.1 CTCs的概述 1869年,澳大利亚学者Thomas Ashworth从一位转移瘤患者的外周血中发现了CTCs。诸多研究认为,肿瘤的原发或转移病灶脱落到外周血的细胞就叫CTCs,它可通过淋巴和血液系统决定肿瘤细胞向其他部位转移。目前已经证实CTCs在各种实体肿瘤患者的血液中广泛存在,并与肺癌患者的转移以及其他肿瘤的预后不良密切相关[20-21]。

2.2 CTCs的检测方法 在早期肿瘤患者血液中CTCs含量很少,即使在晚期肿瘤的患者每106～107个外周血细胞中也才发现一个CTCs,所以通过普通的检测方法很难进行检测。CTCs的检测流程主要分为两部分:CTCs的富集及CTCs的检测。最常用的CTCs分离方法是抗体介导的肿瘤细胞捕获技术,CellSearchTM是美国FDA批准的唯一检测CTCs的方法,它利用上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)涂层磁珠分离CTCs,但研究表明这种检测方法在几种类型的肿瘤中检测效率却很有限。而一种独特的微流控平台“CTCs芯片”能够有效并选择性地从外周血标本中分离出具有活性的CTCs,CTCs芯片由一个微流控平台(针对EpCAM或MUC 1的抗体)组成,它与CTCs相互作用和捕获,提高了灵敏度,简化了预标记样品的步骤,这项技术成功地检测到了约100%的肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和结肠癌的CTCs[20-22]。虽然这种检测技术有很多优点,但是有一些肿瘤细胞亚群仍不能被检测到,可能是因为这些细胞进行了上皮-间充质转化。因此,有研究认为需要将这两种技术结合起来进行联合分析,才能够提高CTCs的检测敏感度。其他的检测方法还有逆转录PCR、酶联免疫检测及自动显微镜系统,最近一项新的检测方法四氯化碳分离技术被开发出来,其可以在很低的浓度下分离CTCs,希望在不久的将来这项技术能真正应用于临床。对于获取的CTCs,可以从分子和细胞层面上进一步进行基因测序、基因表达分析、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、细胞免疫染色及细胞培养等[21-22]。

2.3 CTCs在肺癌靶向治疗中的应用 随着精准医学的发展,NSCLC尤其是肺腺癌患者在治疗前均需对EGFR及ALK基因的状态进行检测,从而为后续的靶向治疗提供指导。目前多项研究证实,通过CTCs来检测EGFR、ALK的突变状态和通过肿瘤组织检测具有很高的一致性。有研究证明在组织与外周血CTCs中EGFR检测率的一致性高达84%[23];另一项研究通过FISH方法检测CTCs中ALK融合基因的表达情况,研究共检测了32例晚期肺癌患者,在18例组织学检测为阳性的患者中,通过CTCs检测,ALK基因均为阳性,14例组织学检测为阴性的患者,通过CTCs检测ALK阳性细胞表达≤1个,并且CTCs中ALK阳性细胞数可用于评估克唑替尼治疗的效果[12]。Pailler等[24]在NSCLC患者中使用微流控装置,应用等位基因特异性聚合酶链式反应进行EGFR突变扩增,在CTCs中检测到L858R、del 19和T790M突变;研究还发现T790M CTCs阳性患者的无进展生存期为7.7个月,而最初T790M阴性患者的无进展生存期为16.5个月;另外通过对CTCs的序列进行分析显示,CTCs的增加与肿瘤的进展有关,在某些情况下还与新的EGFR突变出现有关。Aieta等[25]观察1例NSCLC患者CTCs中EML-ALK水平,发现经过成功的克唑替尼治疗后,CTCs降低。Ilie等[26]对87例肺腺癌患者进行ALK FISH分析,5例组织活检和CTCs分析均为阳性。这些研究证实了CTCs检测可以指导肺癌的治疗,监测治疗耐药性的出现,并可用来预测晚期肺腺癌患者的生存期。2016年的一项研究发现基于CTCs的PD-L1检测对于免疫检查点抑制剂药物PD-1/PD-L1的临床用药具有指导作用,此研究将应用PD-1/PD-L1抑制剂治疗的24例Ⅳ期NSCLC患者的CTCs数目和CTCs上的PD-L1表达进行检测和分析,发现在基线和治疗3个月时,CTCs及其PD-L1的表达与患者的不良反应结果相关;治疗后6个月,所有患者血液中都发现CTCs,其中PD-L1阴性CTCs的患者都获得较好的治疗效果,而PD-L1阳性CTCs的患者则出现了疾病进展[27]。由此可看出通过检测CTCs的PD-L1可成为抗PD-1治疗的预测性生物标志物。

3 TEXs

3.1 TEXs的概述 外泌体是由活细胞分泌的具有脂质双层膜结构、直径40～100 nm的微小囊泡,是通过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程后而形成的胞外纳米级多泡体[28-30]。膜内主要包含有蛋白质、核酸和脂质。TEXs主要包含miRNA和蛋白质,它通过与肿瘤微环境中的其他细胞相互作用来调节肿瘤进展、血管形成平衡、转移和免疫逃逸。Thakur等[29]研究发现,TEXs携带dsDNA,并且其DNA可以反映亲代肿瘤细胞的突变状态。研究表明TEXs可能是肺癌“液体活检”的生物标志物,TEXs能影响肿瘤微环境的形成、增强肿瘤细胞侵袭与转移能力、介导肿瘤免疫抑制及参与肿瘤放化疗抵抗进而促进肿瘤发生与发展[30-32]。因此,TEXs可作为生物标志物对肿瘤的诊断及预后预测提供一定的价值。另外,TEXs含有多种不同的免疫刺激和免疫抑制因子,这些因子支持受体细胞的重新编程,穿梭在信号分子和肿瘤抗原中,在细胞-细胞通讯中发挥重要作用。TEXs的外膜由鞘磷脂组成,这样能保证外泌体的内含物在体液中稳定存在。因此,针对TEXs的液态活检将为疾病的精准医疗、个体化治疗提供更好的研究价值。

3.2 TEXs的检测方法 TEXs的检测包括分离纯化及表征验证,科研工作者最关注的问题是分离纯化,高纯度的TEXs是保证后续研究成功的关键。目前TEXs分离提取的方法主要有超速离心法、蔗糖梯度离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、磁珠免疫法、PEG-base沉底法及试剂盒提取等。超离法操作简单,且获得的囊泡数量较多,成为了研究者最常用的TEXs分离纯化的手段,但超速离心仅能富集TEXs或囊泡的亚型,不能起到纯化的作用。TEXs提取纯化后,在进行临床应用前一般都需要对其进行表征验证。目前表征验证的方法主要有两种,一种是形态学观察,即通过电镜进行观察,可直观了解和掌握TEXs的大小、形态等表观信息[33-35]。另外一种是从分子蛋白水平进行验证,它主要是采用Western blotting方法来检测TEXs的表面标志蛋白质,如CD9、CD63等,与形态学判断比较此方法更为精准。此外,还有一些其他方法,如动态光散射技术、流式细胞技术、纳米微粒追踪分析术等[32-33]。流式细胞技术和纳米微粒追踪分析技术主要是通过荧光信号的传导进行测定,具有很高的分辨率和准确度,并且能进行定量和定性分析,但由于检测成本较高,目前在临床中还未能广泛应用。

3.3 TEXs在肺癌靶向治疗中的应用 大量研究表明TEXs可能是肺癌液态活检的生物标志物,它的灵敏度和特异度比传统的活检方法更高。研究人员检测了肺癌TEXs的标志物,如蛋白质和非编码RNA[34]。Sandfeld-Paulsen等[35]对276例NSCLC患者进行了TEXs检测,并评估了附在体膜上的49种蛋白质,结果显示50%的患者存在食管鳞状细胞癌抗原(new york-esop hageal-1,NY-ESO-1)增高,其是一种非常特异的预后生物标志物。肺癌患者中有两种肿瘤抑制相关miRNA(miRNA-373、miRNA-512),它在激活状态下对肿瘤的生长和侵袭具有抑制作用,研究表明这两种miRNAs水平的下调与NSCLC患者的不良预后相关[36]。通过对肺癌细胞分泌的细胞外囊泡分析发现,TEXs表面高表达CD317和EGFR等,这些分子均可作为诊断NSCLC的可靠生物学标志[34-36]。在临床应用方面,Exosome Diagnostics公司研发的基于血浆TEXs的ExoDx Lung(ALK)诊断试剂盒在2016年初已被美国FDA批准应用于临床。这是全球第一个以血液样本分析TEXs RNA的临床液态活检试剂盒,其能够准确、灵敏、实时地检测NSCLC患者的EML4-ALK突变情况。通过对肿瘤患者组织及血浆检测ALK的表达水平,发现该项检测可以达到88%的诊断灵敏度和100%的特异度。Krug等[37]用NGS方法分析54例NSCLC患者的EGFR激活突变和T790M突变,结果示通过外泌体ES和ctDNA检测EGFR活化突变与组织活检结果的符合率为96%,T790M突变符合率为86%。这些结果表明,ES分析在肺癌诊断中具有一定的应用价值,TEXs可作为肺癌潜在的治疗靶点,且由于肺癌TEXs成分和功能的多样性,可以为肺癌的治疗提供多个潜在的治疗靶点,如黑色素瘤相关基因(mda-9/syntenin)过表达可以促进小细胞肺癌释放TEXs,通过以黑色素瘤相关蛋白为靶点设计的新药可能为肺癌的治疗带来新方法。Yang等[38]也发现促进TEXs中let-7的表达是肺癌治疗的潜在靶点。Rolfo等[39]在研究NSCLC患者和正常人血清中TEXs时发现miR-30b和miR-30c水平升高与EGFR信号传导通路相关,可进一步用来指导靶向药物治疗的敏感性,同时miR-221-3p和miR-222-3p过度表达的患者都与其EGFR突变状态有关,在应用AZD9291治疗的过程中都取得了良好的效果。另外,Jung等[40]通过蛋白质组学分析发现肺癌细胞分泌的TEXs中多种蛋白质成分和磷脂成分参与吉非替尼的耐药性,提示TEXs参与了肺癌靶向药物耐药的发生。

肿瘤细胞还能通过TEXs调节肿瘤免疫。主要是通过携带免疫抑制因子并抑制免疫细胞(如树突状细胞、NK细胞、CD4+和CD8+T淋巴细胞)发挥的抗肿瘤免疫效应,诱导免疫抑制和调节细胞群,如髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)、调节性T细胞(Tregs)、调节性B细胞(Bregs)等,而MDSCs具有抑制T细胞免疫应答的能力。最新肺癌免疫治疗方法之一依赖于阻断T细胞活化的负调节物,如PD-1和PD-L1以及肿瘤微环境中的炎性信号[41]。另一方面,TEXs可以调节肿瘤微环境内的抗炎信号,这可以有效增强肺癌免疫治疗效果。因此,围绕肺癌TEXs的治疗研究将为探索肺癌个体化、精准化治疗策略提供新的思路。

4 展望

液态活检具有无侵入性、可频繁多次检测及快速反映机体变化等优势,具有广泛的应用前景及广阔的发展空间。它不仅可以指导肺癌的分子靶向治疗及治疗过程中的耐药监测;还可以指导肺癌的免疫靶向治疗。然而,现阶段液态活检还不能够取代组织活检的金标准地位。液态活检所提供的信息还需要更先进的技术来做出更深层次的解读。与传统的肿瘤检测方法相比,液态活检是一个不断发展的概念,随着时间推移,其外延也在不断扩展。从广为人知的血液检测到现在的尿液、唾液检测;从蛋白类肿瘤标志物检测,到如今的CTC、ctDNA,再到最近几年兴起的TEXs。液体活检始终是一个试验性、探索性的课题。将来随着检测方法的不断进步,液态活检技术一定能真正用于临床指导肺癌的精准治疗,发挥更大的作用。