吴茱萸次碱：一种多靶点天然化合物的药理学作用研究进展

罗 丹，颜 行

1南昌大学医学院生理学系；2南昌大学药学院基础药理重点实验室，南昌330006

大量临床研究发现，作用于单靶点的药物在治疗动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤等发病机制复杂的疾病时常疗效不佳。而多靶点药物可同时作用于疾病发病机制中的多个靶点，产生协同效应，减少副作用和抗药性的产生，从而达到更佳疗效。中药有效成分往往通过多个靶点而发挥系统治疗作用，是我们设计先导化合物寻找多靶点药物的宝贵资源。传统中药吴茱萸属芸香科植物，始载于《神农本草经》，临床应用已有数千年历史。吴茱萸次碱(rutaecarpine，Rut)是从吴茱萸将近成熟的果实中提取出来的一种吲哚喹啉类生物碱，其化学结构式为C18-H13-N3-O。作为吴茱萸的主要活性成分之一，Rut具有广泛的药理作用[1]，如心血管保护作用、改善脑功能、保护胃黏膜、抗炎抗氧化等，其药理学作用机制涉及多种生物靶点。本文对近十年来文献报道的Rut的作用的靶点及药理学作用，及以Rut为先导化合物开发的衍生物及类似物的相关进展进行综述，为Rut对相关疾病的治疗提供依据。

图1 吴茱萸次碱的化学结构Fig.1 The chemical structure of rutaecarpine

1 Rut的作用靶点

1.1 TRPV1

辣椒素受体(Transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)，属瞬时感受器电位离子通道(TRP)超家族中的成员，是一种多型信号探测器，可被高温、氢离子等理化因素及天然配体如辣椒素、Rut、树脂毒素等激活。TRPV1为一种配体门控的非选择性阳离子通道，激活可产生以Ca2+内流为主的阳离子内流。TPPV1主要分布于感觉神经元末梢，也广泛存在于非神经组织，如血管内皮细胞、平滑肌细胞、单核细胞等。国内外大量研究提示，Rut为TRPV1的激动剂，其多种药理学效应均通过TRPV1介导。最早日本学者Kobayashi在豚鼠的心房肌发现， Rut对心肌有正性肌力和正性频率作用，该效应可被TRPV1非选择性的阻断剂钌红所取消；随后Hu和Deng等的研究相继证实Rut的心脏保护作用及舒张血管和降压作用均与激活TRPV1有关，其效应可被TRPV1竞争性阻断剂Capsazepine所阻断[1]。最近Wang等的研究提供了直接证据，Rut及吴茱萸的另一有效成分吴茱萸碱与辣椒素有相同的结合位点，是TRPV1的部分激动剂[2]。他们采用膜片钳的技术在转染TRPV1受体的HEK293细胞证实，Rut及Evo能激活TRPV1介导的阳离子内流，两者的效应分别比辣椒素低9倍和3.5倍。值得注意的是，辣椒素和吴茱萸碱等TRPV1激动剂反复使用均会产生受体脱敏，而Rut不会产生这种脱敏作用。这提示Rut作为TRPV1部分激动剂，通过适度激活TRPV1产生效应，可能具有更为广泛的临床应用前景。

1.2 NADPH氧化酶

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶是体内活性氧 (Reactive oxygen species，ROS)产生的主要来源之一。Heo等[3]在培养的单核细胞发现， Rut可抑制致动脉粥样硬化因子LIGHT诱导的NADPH的激活和ROS的产生，进而抑制炎症因子的释放和单核细胞迁移。随后，Bao等[4]在心肌细胞的缺氧复氧模型也证实，Rut可抑制NADPH氧化酶的活性，下调NADPH氧化酶亚基Nox2,Nox4,及调节蛋白 p47(phox)表达上调而减少ROS的生成。这些研究提示，Rut可能通过抑制NADPH氧化酶源性的ROS生成而发挥抗氧化应激作用。

1.3 环氧化酶-2

环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)是催化花生四烯酸转化为前列腺素(prostaglandins，PGs)的关键酶，主要包括COX-1和COX-2两种同工酶。前者为结构型，主要存在于正常的组织细胞中，催化产生维持正常生理功能的PGs。后者为诱导型，可被各种病理因素诱导表达，产生大量PGE2，介导炎症反应。因而，COX-2是目前非甾体抗炎药的主要作用靶点。Moon等的研究提示，Rut可能为一种新型的COX-2抑制剂。在骨髓源性的肥大细胞，Rut剂量依赖性地抑制COX依赖性的PGD2生成，在传染了COX-2的HEK293细胞，Rut可抑制外源性花生四烯酸转化为PGE2。Rut并不能抑制COX-1的活性和COX-2的蛋白和mRNA表达水平，提示其可能通过直接抑制COX-2的活性发挥抗炎效应。最近Lee等在培养的小鼠巨噬细胞株RAW264.7中发现，Rut的低毒衍生物Br-Rut可显著抑制脂多糖诱导的COX-2蛋白水平升高[5]。

1.4 胆碱酯酶

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)是体内诱导乙酰胆碱水解失活的关键酶。He等[6]的研究报道，Rut的衍生物表现为高选择性的AChE抑制作用。通过抑制双倒数作图法和分子模型研究结果表明，这些化合物可以分别和AChE的催化活性区及外周阴离子区结合，抑制AChE的水解而增加内源性乙酰胆碱的水平。

1.5 细胞色素P450

细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)是调节内源性和外源性物质(如药物、环境化合物等)代谢的关键酶。大量研究表明Rut可影响CYP450的作用，从而影响药物的代谢过程。这一效应在中药及药物的相互作用中值得注意。在大鼠和小鼠肝脏微粒体的研究发现Rut可诱导 CYP450 1A 和2B。Rut可提高CYP1A2的催化活性，从而促进氨茶碱的分解代谢，两药合用可降低氨茶碱的药效[7]。但也有报道认为Rut可抑制某些CYP酶的活性，如在小鼠和人肝微粒体的研究发现，吴茱萸次碱是一种CYP1A2的选择性抑制剂。最近研究认为Rut的肝脏毒性及诱导药物相互作用可能与抑制CYP1A2，CYP3A4等多种CYPs的活性有关[8]。

1.6 β1肾上腺素能受体

Xue 等[9]结合β1肾上腺能受体/细胞膜层析技术及超高液相色谱/质谱技术筛选发现，Rut是β1受体的拮抗剂，离体实验证实Rut下调β1受体下游cAMP和PKA的水平，在体实验发现Rut通过抑制β1受体调节能量代谢可抑制心肌缺血再灌注损伤。

1.7 胆固醇逆向转运蛋白ABCA1

胆固醇逆向转运蛋白(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)是促进胆固醇外排的关键转运体。Li等[10]的系列研究发现Rut及其衍生物可上调ABCA1的表达，提示Rut具有抗动脉粥样硬化的潜在药理学作用。

2 Rut的药理学作用

2.1 心脏保护作用

在多种心脏缺血模型中均证实Rut具有显著的心脏保护效应，其主要机制均与激活TRPV1受体促进降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)释放有关。CGRP是辣椒素敏感的感觉神经的主要递质，广泛分布于神经和心血管系统中，是一种重要的内源性心肌保护物质。离体心脏灌流和在体实验均发现，Rut可减轻缺血再灌注所致心肌损伤，增加冠脉流出液或血清中CGRP的水平，其心脏保护效应可被竞争性TRPV1受体阻断剂Capsazepine和选择性CGRP受体阻断剂CGRP8-37 取消[1]。此外，Rut还可有效逆转多种病理因素诱导的心脏肥厚。异丙肾上腺素诱导的心脏重构模型中发现，Rut可逆转心脏重构，表现为降低左心室与体重比及心脏横截面积，抑制心肌细胞凋亡和胶原沉积，其机制与上调CGRP水平有关[11]。最近Li等[12]发现，Rut可抑制低氧诱导的右室重构，减少TGF-b诱导的心肌成纤维细胞的增殖，其机制与促进CGRP释放，进而调节eIF3a/p27通路有关。

2.2 对血管的影响

2.2.1 舒张血管和降压

中药吴茱萸内服和外敷均能有效降低血压，其主要成分Rut在离体血管和整体动物水平均证明能有效地舒张血管和降压，可能涉及以下机制： Wang等[13]研究认为，Rut可促进内皮细胞非电压依赖性钙通道开放，升高胞内钙水平，后者通过NO-cGMP途径而发挥内皮依赖性舒张血管作用；而在培养的血管平滑肌细胞，Rut则抑制L型电压依赖性Ca2+通道开放，从而导致Ca2+内流减少，血管平滑肌舒张。Li课题组[14]系列研究则表明Rut的舒血管和降压效应是通过激活TRPV1促CGRP合成和释放所介导的，后者是一种强大的舒血管活性物质，其舒血管效应比乙酰胆碱强1000倍。主要证据如下：在离体的大鼠血管环和在体实验中发现，Rut的舒血管和降压效应均伴随CGRP浓度的升高。预先给予辣椒素耗竭CGRP和CGRP受体阻断剂CGRP8-37，可显著抑制Rut的上述效应。在两肾一夹型高血压大鼠[15]和自发性高血压大鼠模型[16]中均发现，连续口服Rut产生稳定的降压效应，伴随血浆CGRP浓度及背根神经节CGRP的mRNA表达水平升高，这些作用可被预先给予辣椒素所减弱。该课题组最近的研究在稳定转染TRPV1的293细胞和培养的背根神经节细胞发现，Rut可剂量依赖性上调CGRP的表达，该效应可被TRPV1阻断剂CAPZ所取消，Rut可升高细胞内Ca2+的水平[17]。

2.2.2 保护血管内皮

我们前期的研究发现，吴茱萸次碱可抑制LPC诱导的血管内皮损伤和功能紊乱，其机制与激活TRPV1上调内源性血管保护物质CGRP水平有关[18]。循环中的内皮祖细胞在维持内皮完整和促进血管修复有重要生理学意义。内皮祖细胞的衰老和功能失调与多种心血管疾病有密切关系。Zhou等[19]研究发现，高血压状态下内皮祖细胞的衰老加速与体内CGRP生成减少有关，给予Rut激活TRPV1促进内源性CGRP生成可有效抑制高血压和AngII诱导的内皮祖细胞衰老，其效应可被CGRP8-37和capsazepine所阻断。

2.2.3 抑制血管平滑肌增殖

血管平滑肌细胞异常增殖是多种因素诱导血管重构狭窄的重要病理基础。在培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞发现，Rut可下调VSMC增殖相关基因c-myc的表达，上调eNOS促进NO生成，从而抑制Ang II诱导的血管平滑肌细胞增殖[20]。最近有研究报道[21]，Rut可抑制缺氧诱导的人肺动脉血管平滑肌HPASMCs增殖，并诱导其凋亡，其机制与抑制HIF-1α表达及下游信号通路有关，表现为减少PCNA表达，上调p53和 p21的表达。

2.2.4 抗炎

炎症是机体对内外刺激的一种防御反应，也是多种疾病发生发展的病理生理基础。Rut在多种炎症模型中均能起到抗炎作用，可能涉及多种机制。

2.2.3.1 抑制前列素合成

前列腺素PGE2、PGD2在炎症反应中起着重要作用。在培养的小鼠巨噬细胞株RAW264.7中发现，Rut可显著抑制脂多糖诱导的PGE2生成，至少部分介导其抗炎机制[22]。如前所述，Rut可通过抑制PGs合成的限速酶COX- 2而减少前列腺素生成。然而，Woo等在钙离子载体A23187诱导的小鼠巨噬细胞炎症模型发现，Rut可直接抑制合成PGs的前体花生四烯酸释释放，但对COX-1和COX-2活性却无显著影响[23]。

2.2.3.2 抗氧化

众所周知，ROS过度生成诱导基因表达的改变在炎症反应中亦起着重要作用。NADPH氧化酶是体内生成ROS的重要限速酶。日本学者等发现Rut可抑制LIGHT诱导的单核细胞迁移，其机制与抑制NADPH的激活导致的ROS的产生，进而抑制CCR1、CCR2、ICAM-1、 ERK和p38 MAPK等炎症过程[3]。最近Jin等[24]研究发现，Rut可抑制叔丁基过氧化氢诱导的肝细胞损伤，其机制涉及激活CaMKII-PI3K/Akt-Nrf2抗氧化信号途径，上调其下游靶基因血红素氧合酶-1hemeoxygenase-1 (HO-1)HO-1表达，进而抑制AST,ALT和脂质过氧化有关。

2.2.4 抗动脉粥样硬化

大量研究表明Rut具有保护血管内皮、抑制单核细胞迁移粘附、调节血脂、抑制血栓形成等多种抗AS效应，可能是一种潜在的抗AS药物。

2.2.4.1 抑制内皮-单核细胞粘附

循环中的单核细胞与受损的血管内皮粘附，迁移并吞噬脂质发展为泡沫细胞，是动脉粥样硬化斑块形成的关键环节。Rut可抑制致AS因子LIGHT诱导的单核细胞迁移及IL-8、MCP-1、TNF-α等多种炎症介质的释放[3]。近年来大量研究提示缝隙连接蛋白(connexin，Cx)与动脉粥样硬化密切相关，参与介导单核细胞和血管内皮的相互作用。其中Cx37和Cx40被认为有抗AS作用，而Cx43过度表达则有促AS效应。我们最近的研究表明[25,26]，Rut可抑制Ox-LDL诱导的内皮功能紊乱和单核细胞粘附，促进内皮源性Cx37和Cx40及单核源性Cx37的表达，抑制两者Cx43的表达，其机制与激活TRPV1有关。

2.2.4.2 促进胆固醇排出

Yu等[27]研究提示，Rut可通过促进胆固醇外排而抑制AS斑块形成。离体水平， Rut可促进巨噬细胞株RAW264.7中胆固醇外流。在ApoE-/-小鼠，给予Rut八周可显著抑制斑块面积，减少斑块区的胆固醇和巨噬细胞聚集，其机制与促进肝脏中胆固醇逆向转运蛋白ABCA1 和清道夫受体SR-BI/CLA-1的表达有关。

2.2.4.3 抗血栓作用。

血栓形成是动脉粥样硬化斑块形成的终末病理变化。离体和在体的实验均证明Rut可抑制多种因素(如胶原、ADP、肾上腺素和花生四烯酸)诱导的血小板聚集和血栓形成[28]。在小鼠肠系膜上静脉血栓模型，Rut可以显著抑制血小板血栓形成，表现为延长静脉的阻塞时间、出血时间和血小板血栓的潜伏期，其作用甚至超过阳性对照药阿司匹林。此外，静脉注射Rut亦能有效降低ADP诱导的小鼠急性肺血栓栓塞症的死亡率。其抗血小板活化机制可能通过抑制了磷脂酶C的活性，导致磷酸肌醇的分解减少，使血栓烷素A2的生成减少，进而抑制血小板内Ca2+动员[29]。此外，Li等[30]研究认为，Rut抑制血小板聚集的作用与上调CGRP表达有关，后者可抑制血小板源性组织因子TF的释放。

2.3 抑制肥胖与代谢综合症

在高脂饮食诱导和瘦素缺陷两种肥胖小鼠模型的研究发现，Rut可通过抑制摄食而降低肥胖，并降低血脂、血糖和胰岛素水平，其机制与抑制下丘脑中两种具有促进食欲作用的神经肽(神经肽Y和刺鼠色蛋白相关蛋白)的表达有关[31]。Chen等[32]研究发现，Rut及其衍生物可抑制脂肪细胞的分化和脂质合成，减少脂质堆积，其机制与激活AMPK信号通路，抑制非折叠蛋白UPR通路有关。最近在高脂饮食诱导的STZ糖尿大鼠的高脂高糖模型发现，Rut可显著抑制肥胖和内脏脂肪素堆积，减低血脂和血糖，增高胰岛素敏感性。降低肝脏中的NF-KB活性，抑制IL-6,CRP and MCP-1等炎症因子的释放，减轻肝脏和胰脏的病理损伤。前者与通过肝脏的IRS-1/PI3K/Akt通路有关，后者通过AMPK/ACC2促进糖摄取[33]。这些研究提示，Rut具有潜在的减肥和抗糖尿病代谢综合征效应。

2.4 抗阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(Alzeheimer’s，AD)俗称老年性痴呆，是一种进行性发展的神经系统退行性疾病。乙酰胆碱为促进学习记忆的重要神经递质，老年痴呆的重要病理机制之一就是胆碱能神经元的退化。胆碱酯酶抑制剂(AChE)可通过抑制乙酰胆碱的降解而提高内源性乙酰胆碱的水平，因而成为老年痴呆治疗最常用的一类药物。最近有研究报道[6]，Rut的低毒衍生物7，8-脱氢Rut是胆碱酯酶的选择性抑制剂，能减少β-淀粉样蛋白聚集，再加上强大的抗氧化和金属离子螯合作用，提示其可被开发成新型的多功能抗AD药物。

2.5 胃粘膜保护作用

中药吴茱萸治疗胃肠道紊乱已有数千年历史。胃肠道分布有丰富的辣椒素敏感的感觉神经，其主要递质CGRP是一种重要的内源性胃黏膜保护物质，机制涉及促进胃黏膜血流，抑制胃酸分泌，减少胃黏膜细胞的凋亡和氧化损伤等[34]。在阿司匹林[35]和酒精[36]诱导的大鼠胃溃疡模型的研究均发现，Rut可显著降低溃疡指数和H+返流，其机制与激活TRPV1促进CGRP释放有关。

表1 吴茱萸次碱的主要作用靶点和临床应用Table 1 The major targets and clinical applications of rutaecarpine

3 吴茱萸次碱的衍生物和类似物

目前吴茱萸次碱主要通过化学合成或生物提取的方法获得。大量研究通过对吴茱萸次碱结构进行化学修饰，开发出一系列吴茱萸次碱的衍生物和类似物，可改变其药理学活性或理化特性，这些构效关系的研究有助于开发新的选择性更高药效更稳定的天然药物[37]。

在研究Rut及其衍生物的抗血小板活性作用发现，2,3-亚甲二氧基吴茱萸次碱,3-氯代吴茱萸次碱和3-羟基吴茱萸次碱在低浓度就表现为更强的抑制血小板聚集的作用。3-甲氧基吴茱萸次碱的丁酸衍生物还可抑制ADP、胶原等诱导的血小板聚集。这些衍生物均表现为优于吴茱萸次碱的抗血小板活性[38]。

Chen等[39]研究比较了12种Rut的衍生物和11种类似物的舒血管活性，发现N14原子可能是关键部位，该位点的修饰可增加舒血管活性，而5-羰基的作用不大，单纯吲哚或喹唑啉环的取代也不能增加舒血管活性。

在Rut衍生物的抗肿瘤作用的研究发现，不同位点的环取代可导致对不同的肿瘤细胞的选择性毒性。如11-甲氧基吴茱萸次碱表现为对肺癌和肾癌细胞的细胞毒性。10,11-亚甲二氧基 类似物则表现为对卵巢癌细胞的细胞毒性[40]。Rut衍生物的抗肿瘤细胞毒性机制与抑制拓扑异构酶有关，而对拓扑异构酶I和II的抑制作用可能与E环取代有关，如10-溴代吴茱萸次碱和 3-氯代吴茱萸次碱均表现为较强的对拓扑异构酶I和II的抑制作用[41]。

Wang等[42]研究了一系列Rut衍生物对胆碱酯酶的抑制性。这些衍生物的抗胆碱酯酶活性及对乙酰胆碱酯酶(AChE)或丁酰胆碱酯酶(BuChE))的选择性抑制作用可能与骨架结构及侧链的长度有关：如基本骨架中由芳香C环的衍生物较无芳香环及开链结构的衍生物有更强的活性和选择性；7,8-去氢吴茱萸次碱的衍生物较吴茱萸次碱的衍生物及开C环衍生物表现为更强的AChE的高选择性及抑制效应；此外，提高侧链的长度也增加衍生物的选择性和活性[6]。

4 展望

对天然药物有效成分的多靶点调节作用的研究将成为探索中药作用机制，挖掘中药新的临床应用的重要趋势。近年来，吴茱萸的另一个有效成分吴茱萸碱的多靶点抗肿瘤效应倍受关注，其可影响多条信号转导通路而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和血管新生，有望开发为新的多靶点抗肿瘤药物[43]。Rut的抗肿瘤效应较吴茱萸碱弱，但在心脑血管领域有较好临床应用前景。目前研究认为Rut的较多药理学作用均与激活TRPV1有关，后者通过促进钙内流可触发一系列生理学效应。Rut对其他靶点的作用是TRPV1激活胞内钙信号途径的下游机制，还是独立于TRPV1之外的直接作用，尚需研究。并且目前作用靶点大多采用药理学方法推测，其蛋白相互作用及构效关系尚未完全阐明。此外，RUT的低溶解度也是影响其作为药物的生物利用度的重要原因，因而Rut在离体实验水平效果较好，而在整体水平灌胃给药效果欠佳。因而，以吴茱萸次碱为分子骨架，结合计算机分子模拟、基因敲除和药物化学等技术对吴茱萸次碱进行结构创新和靶点确证，明确其构效关系，升高生物活性和生物利用度，降低毒性，是开发吴茱萸次碱这一多靶点药物的趋势。