响应面法优选知母须根总黄酮提取工艺及其解热作用研究

黄 琪，李丽丽，吴德玲*，金传山，许凤清

1安徽中医药大学药学院；2安徽省现代中药重点实验室，合肥 230012

知母为百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloideBunge.)的干燥根茎，具有清热解毒、泻火滋阴等功效[1]。其须根是知母产地加工过程中产生的废弃物，总量占根茎采收总量的30%左右，知母须根的废弃不用造成了一定程度的环境污染和资源浪费。课题组前期研究表明知母须根中主要含有黄酮类、甾体皂苷、多糖等化学成分[2,3]。

天然植物中的黄酮类成分大多具有较好的解热、抗炎的药理活性[4,5]，且有文献研究表明知母须根和主根具有相近的化学成分组成[6]。为更好的利用知母须根这一资源，本研究以知母须根为研究对象，以响应面法优选知母须根总黄酮提取工艺，以干酵母致热大鼠模型研究其解热作用，以探讨其解热的作用机制，为知母须根深度开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司，中国，UV1600)，酶标仪(赛默飞世尔科技公司，美国)。肿瘤坏死因子-α、白介素-6、前列腺素E-2、精氨酸升压素等试剂盒均购于上海谷研实业有限公司，芒果苷对照品(成都领航者生物科技有限公司，中国，批号：4773-96-0)。阿司匹林肠溶片(南京白敬宇制药有限公司，中国，批号：国药准字H32026500)。

安琪高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司，中国，批号：GB/T20886)。

1.2 药材与实验动物

1.2.1 药材

知母须根2017年11月份收集于安徽广印堂中药饮片股份有限公司知母种植基地，经安徽中医药大学金传山教授鉴定为百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloideBunge.)的须根。

1.2.2 实验动物

实验用SPF级SD大鼠(周龄8周，雌雄各半，180～220 g)购于安徽医科大学实验动物中心(许可证号：scxk(皖)2017-001)，实验前适应性喂养3天。

1.3 标准曲线的绘制

1.4 知母须根总黄酮提取工艺及提取量的测定

精密称定知母须根粉末1 g于具塞锥形瓶中，加入适量溶剂进行超声提取，分别考察不同的乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数对知母须根总黄酮提取量的影响，根据1.3项下的线性方程测定总黄酮含量并计算总黄酮的提取量。总黄酮提取量(mg/g)=提取液中总黄酮含量/药材重×100%。

1.4.1 单因素实验

1.4.1.1 乙醇浓度对知母须根总黄酮提取量的影响

固定超声时间为30 min，料液比为1∶40，提取次数为1次，考察乙醇浓度分别为10%、30%、50%、70%、90%等五个水平对知母须根总黄酮提取量的影响，每个因素平行实验5次。实验结果见图1。

1.4.1.2 提取时间对知母须根总黄酮提取量的影响

固定乙醇浓度为70%，料液比为1∶40，提取次数为1次，考察超声提取时间为20、30、40、50、60 min等五个水平对知母须根总黄酮提取量的影响，每个因素平行实验5次。实验结果见图2。

1.4.1.3 料液比对知母须根总黄酮提取量的影响

固定乙醇浓度为70%，提取次数为1次，超声提取时间为40 min，考察料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70等七个水平对知母须根总黄酮提取量的影响，每个因素平行实验5次。实验结果见图3。

1.4.1.4 提取次数对知母须根总黄酮提取量的影响

固定乙醇浓度为70%，超声提取时间为40 min，料液比为1∶50，分别考察提取次数为1、2、3、4、5等对知母须根总黄酮提取量的影响，每个因素平行实验5次。实验结果见图4。

1.4.2 响应面法优选知母须根总黄酮提取工艺

在单因素实验基础上，选取1.4.1项下影响总黄酮提取量的四个因素进行Box-Behnken试验设计，以总黄酮提取量为指标，优选最佳提取条件，因素水平见表1。

1.5 总黄酮提取物的解热作用研究

1.5.1 发热动物模型建立、动物分组及给药

1.5.1.1 干酵母混悬液配制

取干酵母15 g于研钵中，缓慢加入蒸馏水90 mL并研磨至均匀的混悬液，将混悬液倒入烧杯中，然后取10 mL蒸馏水洗涤研钵内壁，最终制备成15%的干酵母混悬液。

1.5.1.2 发热动物模型建立

发热模型建立：将大鼠适应性喂养3天，外部保持环境不变，每日用电子体温计测量肛温2～3次，使其适应电子体温计，取体温于37.0～38.0 ℃且体温变化小于0.3 ℃的大鼠供实验造模用。随机取大鼠若干，每只进行背部皮下注射15%的干酵母混悬液(10 mL/kg)，每隔1 h测定一次肛温，以基础体温上升1 ℃(5 h后)以上的为发热鼠，视为造模成功。

表1 Box-Behnken 试验设计因素水平表Table 1 Factor levels used in Box-Behnken design

1.5.1.3 动物分组及给药

将已测定肛温的实验大鼠随机分5组(正常组、模型组、阿司匹林(阳性药)组、知母须根总黄酮提取物组)，每组10只。前期研究表明，知母须根总黄酮提取物在剂量为4 g/kg时即可发挥解热作用。实验用阳性药为阿司匹林，给药剂量为0.1 g/kg，给药方式为灌胃给药。

给药组先用知母须根总黄酮提取物组连续灌胃给药三天，第四天造模，造模后再灌胃知母须根总黄酮提取物一次，分别于造模前、造模后、末次给药0.5、1、2、3、4、5 h测量各组大鼠肛温。

1.5.2 大鼠血清及下丘脑中细胞因子的测定

待大鼠体温测定后，腹腔注射15%的水合氯醛溶液1 mL/100 g麻醉大鼠，分别进行腹主动脉取血及分离大鼠下丘脑。全血以3 000 rpm离心15 min，取上清液；下丘脑样本称定重量后用生理盐水研磨成10%的下丘脑匀浆；按照试剂盒的要求测定血清及下丘脑中TNF-α，IL-6，AVP，PGE-2水平。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

由实验结果可知，芒果苷在0.83～1.49 μg/mL之间质量浓度与吸光度呈现良好的线性关系，线性方程为y= 0.386 7x+ 0.077 2(r=0.999 5)。结果见图1。

2.2 各因素对总黄酮提取量的影响

由实验结果(图2)可知，不同乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数对知母须根总黄酮提取量均有影响。单因素实验结果显示，以70%乙醇作为最佳提取溶剂，最佳料液比为1∶50，最佳提取时间为40 min，最佳提取次数为2次。

图1 芒果苷对照品线性关系Fig.1 Linear relationship of Mangiferin

2.3 响应面试验数据分析

根据“2.2”项下单因素实验优选出的最佳因素水平，选取乙醇浓度，提取时间，料液比，提取次数等四个因素，采用Box-Behnken进行试验设计，实验共29组，每组实验共平行三份，探讨各因素水平对超声提取知母须根总黄酮提取量的影响，结果见表2。本设计方案中A、B、C、D为三维空间的顶点，构成析因点，析因设计实验共12组；区域中心点为零点，零点实验编号为3、11、13、17、19共5组，作为中心设计实验，可对实验误差进行估算。最终拟合的总黄酮提取量(Y)的二次多项式方程为：

Y=53.62-3.98A-0.022B+0.18C+5.39D-0.73AB-0.46AC+6.71AD-0.090BC-1.22BD-0.075CD-16.89A2-3.48B2-3.12C2-4.92D2

本模型的一次项、二次项等项方差分析结果及模型的决定系数能够反映该分析模型是否可靠，结果见表3。该模型的P<0.05，有一定的著性，另外该模型的校正决定性系数RAdj2=0.504 9，说明该模型对知母须根总黄酮成分超声提取实验的拟合程度好，可靠性较高，能够对实验数据进行解释分析。由A、B、C、D各因素的F值可知，影响知母须根总黄酮提取量的因素从高至低依次是提取次数(D)、乙醇浓度(A)、提取时间(B)、液料比(C)。

由响应面图与等高线图结果显示，固定液料比与提取次数，总黄酮提取量随着乙醇浓度和提取时间的同时增加呈现先升高后下降的趋势，由等高线图可看出，乙醇浓度所呈现的等高线分布较为密集，说明乙醇浓度在总黄酮提取量上较提取时间的影响大，由等高线椭圆的规则程度可以判断，乙醇浓度和提取时间有较为显著的交互作用，另外当乙醇浓度不变时，随着提取时间的增加总黄酮提取量呈现下降趋势，可能原因为部分黄酮类成分在超声过程中结构受到了破坏或发生了转变，故提取时间不宜过长。由此可得即当乙醇浓度为58%～77%时，提取时间为40 min时，知母须根总黄酮响应值最高。固定提取时间与提取次数，随着乙醇浓度和液料比的同时增加总黄酮提取量呈现先升高后下降的趋势，根据分析，当乙醇浓度为58%～77%时，液料比为45～55 mL/g时，知母须根总黄酮响应值最高。分析比较并模拟出最佳提取工艺：乙醇浓度为70%，提取时间40 min，液料比为50 mL/g，提取次数2次。在此条件下，知母须根总黄酮成分含量的预测值为53.62 mg/g。

图2 不同因素对知母须根总黄酮提取量(mg/g)的影响Fig.2 Effects of different factors on Total Flavonoids (mg/g) Extracted from the fibrous root of Anemarrhena asphodeloides 注：A：乙醇浓度；B：超声提取时间；C：料液比；D：提取次数Note:A:the ethanol concentration;B:the extraction time;C:the material liquid ratio;D:the extraction times

表2 响应面实验结果Table 2 The Results of Response Surface Experiment

续表2(Continued Tab.2)

编号No.A乙醇浓度Ethanol concentration(%)B提取时间Extraction time(min)C料液比Material-liquid ratio(mL/g)D提取次数Extraction times总黄酮提取量Contet of total flavonoids(mg/g)20903050229.1621504060233.6222503050230.1723504050335.4424705050135.1325705060250.9726705040250.4827703060252.2328904040230.4329704040354.45

表3 方差分析结果Table 3 The results of variance analysis

2.4 验证试验结果

根据所拟合的最佳提取条件进行验证试验，共平行3次，所得知母须根总黄酮含量为53.79 mg/g，与模型预测值53.62 mg/g接近，表明该模型重现性良好。

图3 乙醇浓度和提取时间对知母总黄酮提取量影响的响应面图和等高线图Fig.3 The effects of ethanol concentration and extraction time on the extraction of total flavonoids from the fibrous root of Anemarrhena by response surface methodology and contour map

图4 乙醇浓度和液料比对知母总黄酮提取量影响的响应面图和等高线图Fig.4 The effects of ethanol concentration and liquid to material ratio on the extraction of total flavonoids from the fibrous root of Anemarrhena by response surface methodology and contour map

图5 乙醇浓度和提取次数对知母总黄酮提取量影响的响应面图和等高线图Fig.5 The effects of ethanol concentration and extraction times on the extraction of total flavonoids from the fibrous root of Anemarrhena by response surface methodology and contour map

图6 提取时间和液料比对知母总黄酮提取量影响的响应面图和等高线图Fig.6 The effects of extraction times and on the extraction of total flavonoids from the fibrous root of Anemarrhena by response surface methodology and contour map

图7 提取时间和提取次数对知母总黄酮提取量影响的响应面图和等高线图Fig.7 The effects of extraction duration and liquid to material ratio on the extraction of total flavonoids from the fibrous root of Anemarrhena by response surface methodology and contour map

图8 液料比和提取次数对知母总黄酮提取量影响的响应面图和等高线图Fig.8 The effects of extraction liquid to material and ratio times on the extraction of total flavonoids from the fibrous root of Anemarrhena by response surface methodology and contour map

2.5 大鼠体温测定结果

实验结果(见表4)显示造模后5 h内，与正常组相比，模型组大鼠体温显著升高(P<0.01)，表明造模成功。知母须根总黄酮提取物在末次给药5 h后与模型组相比体温显著下降(P<0.05)，表明知母须根总黄酮提取物有一定的解热作用。

组别Group剂量Dose(g/kg)造模前Before modeling造模后Aftermodeling给药后体温Body temperature after administration(℃)0.5 h1 h2 h3 h4 h5 h正常组 Control-37.61±0.2437.52±0.1837.61±0.1337.65±0.1937.64±0.2437.62±0.2437.64±0.1237.41±0.21模型组 Model-37.80±0.2639.43±0.28##39.62±0.25##39.40±0.29##39.41±0.19##39.27±0.17##39.15±0.18##39.22±0.19##阿司匹林组 Asprin0.137.92±0.2239.41±0.1838.84±0.1538.33±0.19∗37.92±0.19∗∗37.91±0.15∗∗37.64±0.28∗∗37.73±0.28∗∗总黄酮提取物 TF4.037.84±0.1639.37±0.2939.44±0.2139.17±0.2439.17±0.2339.13±0.2139.03±0.2338.38±0.29∗

注：与正常组相比##P<0.01，与模型组相比**P<0.01，*P<0.05。
Note:##P<0.01vs control group,**P<0.01，*P<0.05 vs model group.

2.5 血清中相关细胞因子的测定

血清中相关因子测定结果显示，与正常组相比，模型组大鼠血清中TNF-α、PGE-2、IL-6、AVP含量显著升高。与模型组相比，知母须根总黄酮提取物可降低血清中TNF-α、PGE-2(P<0.05)及IL-6(P<0.001)的含量，升高血清AVP(P<0.05)的含量。

组别 GroupTNF-α (ng/L) PGE-2 (ng/L) IL-6 (ng/mL) AVP (ng/L) 正常组 Control613.22±56.29314.77±62.3392.87±5.9934.39±4.50模型组 Model751.97±121.4#578.34±58.71###165.65±13.32###57.65±9.19###阿司匹林组 Asprin563.49±60.53∗∗371.65±97.41∗∗∗101.93±16.72∗∗∗75.58±3.07∗∗∗总黄酮提取物组 TF634.03±78.09∗449.71±111.99∗136.5±12.11∗∗∗66.01±12.11∗

注：与正常组相比#P<0.05，###P<0.001；与模型组相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
Note:#P<0.05，###P<0.001vscontrol group;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsmodel group.

2.6 大鼠下丘脑中相关细胞因子的测定

下丘脑中相关因子测定结果显示，与模型组相比，知母须根总黄酮提取物可降低大鼠下丘脑中TNF-α(P<0.05)、IL-6、PGE-2(P<0.01)的含量，升高下丘脑中AVP(P<0.05)的含量。结果见表6。

组别GroupTNF-α (pg/mg) IL-6 (pg/mg) PGE-2 (pg/mg) AVP (pg/mg) 正常组 Control594.8±59.3128.3±33.1398.9±117.833.9±7.7模型组 Model726.7±107.2##201.0±41.6##748.5±110.9##43.9±5.9##阿司匹林组 Asprin604.5±51.8∗∗116.3±18.4∗∗512.8±67.9∗∗65.4±6.6∗∗总黄酮提取物组 TF620.6±76.2∗126.9±19.1∗∗568.5±71.7∗∗50.3±5.1∗

注：与正常组相比#P<0.05，##P<0.01;与模型组相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
Note:#P<0.05,##P<0.01vs control group;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs model group.

3 结论

本文采用了Box-Behnken方法优选出知母须根总黄酮最佳提取工艺为乙醇浓度70%，提取时间40 min，液料比50 mL/g，提取次数2次。解热实验研究表明，知母须根总黄酮提取物具有一定的解热作用，其解热机制可能是通过降低发热大鼠模型血清中TNF-α、PGE-2、IL-6的含量、升高发热大鼠模型血清中AVP的含量而发挥作用的。

芒果苷是知母须根中成分含量较高的一种黄酮苷类成分，且知母须根中各主要黄酮苷类成分在258 nm下均有较强紫外吸收[8]，因此选择芒果苷为对照品具有合理性。超声提取法具有操作简便，提取时间短，提取效率高等优势，因此本文优选出的最佳工艺具有较强的可操作性。

TNF-α是一种内源性致热原，是发热疾病过程中的一个中间环节，模型组的大鼠血清TNF-α显著升高，因此导致大鼠发热[9,10]，PGE-2是体温调节最主要的物质，尤其是在感染性发热中其含量会显著升高，PGE-2与受体结合后影响体温调节点水平，从而引起机体体温的变化[11]，IL-6 是各种发热的中间物质，其生物学效应呈现多样性，在发热机制中具有举足轻重的作用[12]。AVP是内源性的解热物质，在机体发热时机体会通过分泌AVP来保护机体[13]。本文研究结果表明知母须根总黄酮提取物可以显著降低发热大鼠血清及下丘脑中TNF-α、PGE-2、IL-6的含量，升高AVP的含量，表明知母须根总黄酮提取物具有一定的解热作用。

知母须根是知母生长发育过程中的非药用部位，其与知母主根从同一组织生长分化而来。知母药性寒凉、具有清热解毒之功，本文研究结果表明，知母须根总黄酮提取物也同样具有一定的解热作用，可为知母须根的综合开发利用提供一定的依据。然而天然药物中化学成分较多，其发挥药效作用的机制复杂，知母须根总黄酮的解热作用和化学成分尚需进一步研究。