当归不同提取液中阿魏酸、咖啡酸含量及抗氧化作用的比较研究

管西芹，毛近隆，闫 滨，王丹丹，张欣欣，周洪雷

1山东中医药大学药学院；2山东中医药大学中医学院，济南 250355

当归是伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，性温，味辛、甘，归肝、心、脾经，具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效。现代药理研究表明，当归具有抗氧化、抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗血小板凝聚、抗动脉粥样硬化、抗衰老、增强免疫力等药理作用[1，2]。当归是最常用的中药之一，具有“十方九归”之誉，尤其临床上作为补血活血药在心脑血管系统中广泛应用。

心脑血管疾病与氧化应激损伤密切相关，当归中的抗氧化物质可降低机体的氧化损伤。研究报道，当归芍药散[3]具有清除羟自由基、超氧阴离子的作用，明显抑制脑过氧化脂质的生成，显著提高衰老小鼠和缺血/再灌损伤大鼠脑、血清中的SOD活力，降低血清中MDA的含量；当归补血汤[4]在大鼠心肌缺血模型中，明显降低血清中TNF-α、IL-6和MDA的含量，提高血清中SOD、CAT和GPx的活力，显著改善冠脉结扎诱导的心脏病理学改变，其作用机制与调节氧化应激相关细胞因子及蛋白表达水平有关。

当归中的抗氧化药效物质报道有酚酸类[5]、黄酮类[6]、当归多糖[7,8]以及当归内酯[9,10]等。当归中有机酸类成分含量较多，中国药典[11]规定当归中阿魏酸的含量不低于0.050%(也即0.5 mg/g)，在不同产地[12]当归中的阿魏酸为0.46～1.95 mg/g，在不同炮制[13]当归中的阿魏酸为0.12～0.75 mg/g。从生化途径看，咖啡酸与阿魏酸都是由莽草酸通过系列反应生成的肉桂酸衍生物[14]，当归中也有少量咖啡酸，但国内研究鲜有报道。

1 实验材料

当归(产地甘肃，批号161101)：山东百味堂中药饮片有限公司生产，购于山东中医药大学第一附属医院中药房，粉碎，过三号筛。按照《中国药典》2015年版1部[11]测定当归中阿魏酸的含量为0.069%(也即0.69 mg/g)，符合药典不少于0.050%的要求。

仪器与试剂：阿魏酸(上海诗丹徳公司；批号588)、咖啡酸(上海诗丹徳公司；批号2681)；DPPH(北京中生瑞泰科技有限公司；批号160506)，ABTS(上海阿拉丁生化科技股份有限公司；批号#K1517067)，维生素C(Vc)(上海源叶生物科技有限公司；批号160709)；乙腈为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司；沪试)，乙醇为分析纯(国药集团化学试剂有限公司；沪试)，娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。LC-10ATvp高效液相色谱仪(岛津，日本)；SPD-10A检测器(岛津，日本)；ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm，5 μm)色谱柱(安捷伦，美国)；FA1004N电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；QE-300高速万能粉碎机(浙江屹立工贸公司)，Spectra Max多功能读板机(美谷分子仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 当归提取液中阿魏酸与咖啡酸含量的测定

2.1.1 色谱条件

ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×150 mm，5 μm)，流动相乙腈- 0.085%磷酸水溶液(17∶83)，检测波长为316 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，柱温为35 ℃。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取阿魏酸对照品0.0019 g，咖啡酸0.0014 g，分别置10 mL容量瓶中，70%甲醇定容，即得对照品储备液，移液枪分别移取对照品储备液各200 μL置2 mL EP管，加入1600 μL 70%甲醇溶液制成每1 mL含阿魏酸19 μg和咖啡酸14 μg的混合对照品溶液，微孔滤膜(0.45 μm)过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备

取0.5 g当归粉末，放入圆底烧瓶，加入50 mL蒸馏水，称重记录，加热回流1 h，放冷，溶剂补足失重，混匀，即得当归水提液。同法，得到不同溶剂的当归提取液，提取溶剂分别为30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、酸水溶液(HCl调节pH为2～3)、碱水溶液(NaOH调节pH为11～12)，酸水与碱水提取液分别用NaOH和HCl将pH调至中性，移液枪移取200 μL当归提取液置2 mL EP管，加入1800 μL 70%甲醇溶液，微孔滤膜(0.45 μm)过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 含量测定

取步骤“2.1.3”所得供试品溶液，按拟定的色谱条件进样，记录保留时间与峰面积，外标一点法计算阿魏酸与咖啡酸的含量(mg/g)，结果见表1。

线性关系考察：分别取19 μg/mL的阿魏酸标对照品溶液和14 μg/mL的咖啡酸标准品溶液各0.01、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43 mL置10 mL容量瓶，70%甲醇定容，共得6个不同浓度的混合对照品溶液，按拟定的色谱条件进样，以对照品浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。阿魏酸的标准曲线为Y=56 489X+756.96，R2=0.999 3；咖啡酸的标准曲线为Y=55 224X-1 645.6，R2=0.999 1。

精密度检验：取阿魏酸和咖啡酸混合对照品溶液，按拟定的色谱条件连续进样6次，记录阿魏酸和咖啡酸的峰面积，计算两组分峰面积的 RSD 分别为 0.3% 和 0.5%，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取6份同一批次当归药材粉末，精密称定，按照“2.1.3”步骤用70%乙醇提取，按拟定的色谱条件进样分析。阿魏酸和咖啡酸含量的 RSD 分别为 0.9% 和1.5%。

稳定性试验：取同一供试品溶液，室温放置，分别于 0、2、4、6、8、10 h，按拟定的色谱条件进样分析。阿魏酸和咖啡酸峰面积的 RSD 分别为 1.7% 和 3%。结果表明供试品溶液在10 h内稳定。

加样回收率考察：取同一批次已知含量的当归粉末6份，加入已知浓度的混合标准品溶液适量，再加入70%乙醇溶液50 mL，按照“2.1.3”制备供试品溶液，按拟定的色谱条件进样，计算加样回收率。阿魏酸的加样回收率为 98.3%，RSD为1.3%，咖啡酸的加样回收率为 96.3%，RSD 为1.9%。

2.2 当归提取液抗氧化活性的研究

2.2.1 DPPH·自由基清除能力的研究

参考文献[15]的方法，并稍作改进。将当归不同溶剂的提取液稀释成不同浓度的测试液，Vc作参照品。移液枪移取测试液50 μL置96孔板内，设两个副孔，再加入120 μg/mL的DPPH溶液100 μL，对照组用70%乙醇代替不同浓度的测试液，避光反应30 min，用多功能读板机在517 nm处测各孔的吸光度，分别记作A测试和A对照，按照下述公式计算清除率。

参考文 献[15]的方法，并稍作改进。用95%乙醇配制135 μg/mL的ABTS工作液，将当归提取液用乙醇稀释成一系列不同浓度的测试液，Vc做参照品。移取50 μL不同浓度的提取液和100 μL ABTS工作液置96孔板内，设两个副孔，对照组用95%乙醇代替不同浓度的当归提取液，避光反应6 min，用多功能读板机在734 nm处测各孔的吸光度，分别记作A测试和A对照，计算公式与DPPH相同。

自由基清除能力以半数抑制率(IC50)来衡量，IC50是指清除率为50%时的药物浓度(以每毫升测试溶液相当于原药材的质量来表示)，IC50值越小其清除自由基的能力越强。IC50值以浓度为横坐标，以清除率为纵坐标做回归方程来计算求得。

3 结果与分析

3.1 阿魏酸和咖啡酸的含量测定

按照“2.1.1”的色谱条件进样，检测单一对照品、混合对照品及供试品溶液的色谱图，通过比较有2个主要色谱峰(如图1-A和图1-B所示)，咖啡酸和阿魏酸的保留时间分别为4.046 min和8.873 min，按外标一点法分别计算供试品中阿魏酸和咖啡酸的含量，结果如表1所示。将当归用70%甲醇提取时，阿魏酸的含量为0.690 mg/g，咖啡酸为0.039 mg/g，其中阿魏酸的含量与王婕等[12]报道相近；当归用纯水提取时咖啡酸的含量为0.071 mg/g，与Li等[16]报道基本一致。

图1 混合对照品溶液(A)和当归水提取液(B)的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference solution (A) and extract of water from Angelica (B)

当归以不同溶剂提取时，阿魏酸的含量为0.574～0.707 mg/g，咖啡酸的含量为0.012～0.082 mg/g，并呈现出一定的规律，如图2所示。当归以不同醇浓度的溶剂提取时，随着乙醇浓度的增加，咖啡酸的溶出逐渐降低，从0.071 mg/g降低到0.012 mg/g；而阿魏酸的含量在30%乙醇时最高，从0.597 mg/g增加到0.652 mg/g，又逐渐降低至0.574 mg/g。当归以不同酸碱度的溶剂提取时，碱性条件下阿魏酸和咖啡酸的含量最高，分别为0.707 mg/g和0.082 mg/g，酸性条件下不利于咖啡酸但有利于阿魏酸的溶出。

表1 当归提取液中咖啡酸与阿魏酸的含量(n=3)Table 1 The content of Caffeic acid and Ferulic acid in Angelica extract(n=3)

图2 不同溶剂对提取液中阿魏酸(FA)与咖啡酸(CA)含量的影响Fig.2 Effect of different solvents on the contents of ferulic acid (FA) and caffeic acid (CA) in extrects

图3 不同提取液对DPPH·和自由基清除能力比较Fig.3 Comparison of scavenging activity on DPPH and free redical of different extrects注：a：酸水，b：碱水，c：纯水，d：30%乙醇，e：50%乙醇，f：70%乙醇，g：95%乙醇。Note:a:Acid water,b:Alkaline water,c:Water,d:30% Ethanol,e:50% Ethanol,f:70% Ethanol,g:95% Ethanol.

3.2 当归提取液对DPPH·和自由基的清除能力

从图3-C可以看出不同条件下的当归提取液对DPPH自由基都具有一定的清除作用，在碱水溶液提取时阿魏酸和咖啡酸的含量最高，清除DPPH自由基的能力最强，IC50值为5.373 mg/mL；在醇溶液提取时，清除DPPH自由基的能力随乙醇浓度的增加，呈现先升高后降低趋势；在30%乙醇提取时活性最高，IC50值为5.641 mg/mL；纯水或95%乙醇提取时的清除能力都较弱，其中95%乙醇时阿魏酸和咖啡酸的含量最低，清除DPPH自由基的能力最弱，其IC50值大于10 mg/mL。

4 讨论

在反相色谱柱为ZORBAX SB-C18，乙腈-0.085%磷酸水溶液(17∶83)，检测波长为316 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，柱温为35 ℃条件下检测，当归中两种酚酸类物质的HPLC保留时间比较，咖啡酸(4.046 min)较小，阿魏酸(8.873 min)较大，由于咖啡酸有2个酚羟基，其极性大而保留时间小。当归以不同的溶剂提取时，阿魏酸的含量为0.574～0.707 mg/g，咖啡酸为0.012～0.082 mg/g。当归用95%乙醇提取时，阿魏酸和咖啡酸的含量最低，分别为0.574 mg/g和0.012 mg/g；而碱水溶液有利于酚酸类物质的水解和溶出，阿魏酸和咖啡酸的含量最高，分别为0.707 mg/g和0.082 mg/g。