纳米羟基磷灰石复合物治疗骨缺损的研究进展

孙浩远，宋科官

羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是脊椎动物骨骼和牙齿的主要无机矿物成分，由六方柱状单晶构成，分子式为Ca10(PO4)6(OH)2，微溶于纯水，呈弱碱性（pH值7～9），易溶于酸而难溶于碱[1]。由于人工合成HA的超微结构与人体骨组织相似且具有很好的生物相容性，因此成为骨科和牙科植入物的理想材料[2]。纳米羟基磷灰石（nano hydroxyapatite，nHA）生物相容性更加优异，同时具有一定的骨引导力，但机械性能低、脆性大、不耐疲劳等不足限制了nHA在临床上的应用[3]。因此，在骨组织工程研究中常选择合适的材料与nHA进行复合，用于修复骨肿瘤、外伤、感染等多种原因导致的骨缺损。针对这一骨科领域的热点问题，本文对各类nHA复合人工骨材料的最新进展进行综述。

1 nHA-多糖类复合材料

1.1 nHA-壳聚糖复合材料

壳聚糖是一种由氨基葡萄糖和N-二氨基葡萄糖组成的线性多糖，具有（1-4）糖苷键，被作为抗菌材料、组织创伤愈合及再生材料广泛应用于生物领域[4]。壳聚糖可根据不同需要制作成微球型、生物膜型及各种三维支架，具有优良的成孔能力、阴离子结合能力、抗菌活性和生物降解性，但生物支撑性能欠佳[5-6]。

nHA与壳聚糖复合后可模拟正常骨组织的结构，提高其生物力学性能。nHA-壳聚糖复合物的制备方法很多，最常用的是原位化学法[7]。Kong等[8]原位制备的nHA-壳聚糖支架孔隙率95%，孔径20～60 μm，成孔能力和生物相容性良好；而该支架的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性约为纯壳聚糖支架的6倍，抗压能力则高出0.511 MPa。

研究显示，nHA-壳聚糖复合材料在仿生过程中更易形成磷灰石，提示其具有较好的矿化活性，成骨水平也更高[9]。而在小鼠间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向成骨细胞分化的作用研究中，人们发现nHA-壳聚糖纤维支架有更好的MSCs附着和增殖功能，在无成骨培养基的情况下也可上调胶原蛋白Ⅰ、Runt相关转录因子（Runt-related transcription factor，Runx）-2，ALP和骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）等成骨基因标记物的表达水平[10]。

Zhang等[11]在兔节段性骨缺损中分别植入nHA-壳聚糖复合支架与纯壳聚糖支架，结果发现植入nHA-壳聚糖复合支架的成骨性能高于单纯壳聚糖支架组。亦有研究表明，与纯壳聚糖支架相比，nHA-壳聚糖复合支架不仅能诱导成骨细胞分泌更多的细胞基质，提高骨钙蛋白含量，植入鼠颅骨骨缺损模型后还能表现出良好的生物相容性和骨传导性[12]。然而，尽管nHA-壳聚糖复合支架应用于骨缺损修复潜力巨大，但仍需进一步优化其在生物降解性、骨传导性等方面的功能，以便未来更适用于临床。

1.2 其他nHA-壳聚糖复合材料

nHA还可与细菌纤维素结合，生物安全性及降解性良好，除可促进成骨细胞增殖外，还具有一定的骨支撑能力[13]，但目前研究多停留在安全性及生物相容性方面，机械性能、结构等研究尚嫌不足。除此之外，肝素、硫酸软骨素等多糖复合物也可与nHA复合，以满足骨缺损修复对人工骨替代材料的不同需求[14-15]。

2 nHA-蛋白质类复合材料

2.1 nHA-胶原复合材料

2.1.1 生物学性能 胶原蛋白是骨骼的主要成分，具有直径50～500 nm的纤维结构，这种纳米尺寸的胶原蛋白可影响细胞的附着、增殖和成骨能力。而nHA在骨组织中长约50 nm、宽约25 nm、厚2～5 nm，其在骨组织中的排列方向受到组织中胶原纤维分子的影响[16]，与胶原复合后可模仿天然骨的组成和结构，是目前骨组织工程生物材料研究的热点之一。此外，nHA-人样胶原支架还具有均一的相互连接的大孔结构，可承受（2.67±0.37）MPa的压缩应力，明显高于人工骨[17]。

2.1.2 制备方法 nHA-胶原蛋白的主要制备方法是原位免疫法。对此法制备的由分层组装胶原蛋白和nHA共同组成的纳米复合物进行观测，可发现复合材料中的nHA颗粒尺寸约50～100 nm[18]。研究发现，使用1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺作为交联剂，通过冷冻凝胶技术制成不同比例的胶原-nHA支架，其细胞增殖能力和机械强度也高于胶原支架[19]。

2.1.3 在骨修复研究中的应用 体外研究证实了nHA胶原复合支架可提高MSCs的黏附、增殖和分化能力[20]。Hayrapetyan等[21]制备的nHA-胶原复合物支架力学强度可达到天然松质骨的下限（1 MPa），1周内可观察到成骨细胞在多孔复合支架上黏附、扩散和增殖，提示该支架可明显增强MSCs的成骨能力。有学者采用nHA-胶原复合物修复29例骨缺损，术后1～3个月X线片显示nHA-胶原材料与缺损周围骨组织界限模糊，3～6个月复合材料与骨组织融为一体，达到骨性连接[22]，提示nHA-胶原材料是治疗四肢骨缺损的理想植骨填充材料之一。

2.2 nHA-明胶复合材料

明胶是一种半透明固体物质，含有明胶的nHA是骨组织工程研究的重要复合材料之一[23]。殷海荣等[24]采用湿法共沉淀制备nHA-明胶复合物，在其中加入戊二酸对明胶进行交联，对复合材料进行超声处理，既可避免明胶过早降解，又能提高复合物的拉伸强度和抗压强度（分别为66.4 MPa、67.8 MPa）。Azami等[25]制备合成孔径在300～500 μm之间的nHA-明胶复合材料,以明胶滴为微反应器，在胶体保护介质的油包水乳液中合成nHA-明胶微粒，其中可观察到针状nHA晶体，制备的微球平均粒径7.5 μm，粒径分布窄，分散度高，形成天然多孔结构。

体外试验则证实，nHA-明胶复合材料生物相容性良好，具有修复骨缺损的合适结构，可用于制作骨组织工程支架[26-27]。但其力学性能较差，通常需要与其他材料进行交联制备，nHA、明胶、聚乙烯醇三者混合制备可大大提高nHA复合材料的强度[28]。

2.3 nHA-丝素蛋白复合材料

丝素蛋白（silk fibroin，SF）因其优越的生物降解性、良好的生物相容性和极其轻微的炎症反应而在骨组织工程研究中深受关注[29-30]。有研究表明，采用冷冻干燥技术制备的nHA-SF支架其抗压强度明显增大，为2.0～3.2 MPa，而以共沉淀法制备的直径约10 nm、晶体长度为50～80 nm的针状nHA在多孔nHA-SF支架中分布均匀[31]。

孙庆治[32]采用冷冻干燥技术制备nHA-SF支架，植入兔股骨骨缺损模型后12周，影像学检查提示植入支架完全降解，骨缺损被新生骨组织取代，因此肯定了nHA-SF支架的生物降解能力及成骨能力。Wei等[33]以电纺丝技术为基础并采用钙-磷交替浸泡法制备的nHA-SF支架和纯丝素支架上培养成骨细胞，在培养第7 d后通过检测ALP的活性提示nHA-SF支架可显著提高成骨细胞活性。

3 nHA-高分子聚合物复合材料

3.1 nHA-聚酯类复合材料

3.1.1 nHA-聚乳酸复合材料 聚乳酸（polylactic acid，PLA）因其良好的生物降解性、生物相容性和热塑性，成为骨组织工程中应用最广泛的合成聚合物之一，nHA与PLA材料复合后具备了骨传导性、骨诱导性和抗压缩力学性能。黄江鸿等[34]研究发现当nHA-PLA复合物中nHA含量为20%时，该复合物具有更优的力学性能和降解性能。

众所周知，骨缺损替代材料不仅要考虑其骨诱导能力，材料本身的机械强度也至关重要。针对这一点，目前主要采用诱导相分离技术和不同的分散方法（机械搅拌法、原位沉淀法和超声波法、原位聚合法和熔融共混法）制备nHA-PLA复合支架[35]。由棒状nHA颗粒通过热诱导相分离法制备而成的nHA-PLA复合支架，其平均尺寸可达到长100～400 nm、宽37～65 nm，力学性能明显改善[36]。Hong等[37]运用冷冻干燥及交联法制备nHA含量为4%的PLA复合材料，拉伸强度、弯曲强度和冲击强度均得到提升。而采用热诱导相分离法制备的多孔nHA-胶原-PLA-壳聚糖微球复合支架，随着微球中nHA含量从0%增加到50%，其抗压强度从1.42 MPa提高到1.63 MPa，压缩模量从15.4 MPa提高到25.5 MPa[38]。

其他常用的制备方法还有以下几种。Nejati等[39]采用固液分离法制备nHA/PLA复合材料支架，孔隙率高达85%，孔径64～175 μm，抗压强度8.46 MPa，而单纯由PLA制成的微复合支架抗压强度只有1.79 MPa。Zhang等[40]运用喷气纺纱法制备nHA-PLA纳米复合材料，当nHA含量为20%时，其抗压强度和杨氏模量分别为155 MPa和3.6 GPa，支架上mc3t3成骨细胞的生长和增殖速度均高于普通PLA支架。采用微光固化法制备nHA-PLA复合树脂，则是将不同量的nHA粉体和液体光引发剂混合到光交联聚二丙烯酸酯树脂中，随着nHA含量的增加，复合nHA-PLA网络材料的弹性模量随之增大[41]。亦有研究显示，通过共混法制备的nHA壳聚糖-PLA复合材料，其中nHA含量为60%～67%时，材料的抗压强度高达160 MPa，nHA的加入提高了支架材料的压缩力学性能[42]。

采用喷气纺丝制备nHA-PLA三维复合纳米纤维支架，将该支架应用于体外培养MC3T3-E1成骨样细胞，提示其具有良好的细胞依附能力[43]。而3D打印nHA-PLA复合支架在兔骨缺损模型中的应用结果则表明，该复合支架具有增强骨生成和体内骨传导的功能[44]。

尽管nHA-PLA材料在骨组织工程研究中应用广泛，但目前缺少横向比较，无法明确制备技术及nHA、PLA配比量对nHA-PLA复合物整体性能的影响，这也是未来研究的一个主要方向。

3.1.2 nHA-聚己内酯复合材料 聚己内酯（polycaprolactone，PCL）是一种在骨与软骨领域非常有前景的生物可吸收聚合物，其性质稳定，价格低廉。目前PCL基聚合物和陶瓷纳米复合材料的相关研究是骨组织工程领域的一大热点[45]。然而，PCL存在的生物活性问题导致新的骨组织无法与聚合物表面紧密结合。Heo等[46]采用改良快速成型方法制备nHA-PCL和mHA（micro hydroxyapatite）-PCL支架，其尺寸范围分别为20～90 nm和20～80 μm，其中nHA支架具有良好的连通性，孔隙率为72%～73%，孔径为500 μm。而对PCL-nHA复合材料断裂表面的观察则显示，nHA在PCL基体中分散良好，分布均匀；力学测试结果表明，与单纯的PCL相比，PCL-nHA复合材料的杨氏模量和压缩模量都有所提高，nHA含量在复合物中达到50%时，可使该复合材料杨氏模量从193 MPa增加到665 MPa，压缩模数从230 MPa增加到487 MPa[47]。

nHA-PCL能够支持MSCs的生长并引导MSCs成骨分化，在复合纳米纤维上培养BMSCs时nHA与PCL纳米纤维结合并不会影响细胞活力，矿物相的存在还提高了成骨细胞相关基因（如Runx-2和骨唾液蛋白）的ALP活性和mRNA表达水平[48]。而采用单层电纺支架制备nHA-PCL纤维支架，在该支架上培养成骨细胞，细胞矿化和ALP活性与对照组相比均有不同程度的提高[49]。上述基础研究提示，nHA-PCL不仅在机械性能上满足了植骨需求，而且能够促进成骨细胞的矿化能力，是一种理想的骨填充材料。

3.1.3 nHA-聚乳酸-聚乙醇酸复合材料 聚乳酸-聚乙醇酸[poly(lactic-co-glycolic)acid，PLGA]是一种可生物降解的共聚物，广泛应用于医用植入物和药物控释方面[50]。通过选择性激光烧结法制备PLGA-nHA复合多孔支架，随着nHA含量从0%增加到20%，支架的抗压强度从1.82 MPa提高到3.28 MPa，模量从22.75 MPa提高到32.81 MPa[51]。采用静电纺丝法制备含有nHA的PLGA纤维复合支架，其平均直径为（266.6±73）nm；nHA-PLGA复合条带则可采用溶剂浇铸法、气体发泡和颗粒浸出法制备，无需使用有机溶剂[52-53]。

有研究表明，按不同比例复合nHA与PLGA，所制备的支架材料对骨细胞的诱导能力有所不同，将两种配比的nHA-PLGA（20/80和50/50）微球基复合支架植入兔股骨骨缺损模型中，8周后可发现，nHA-PLGA（20/80）较nHA-PLGA（50/50）有更好的成骨作用，提示制备复合支架时应考虑nHA-PLGA复合材料中nHA的浓度，其对复合材料的生物相容性、降解速率和骨传导性均有重要影响[54]。另有研究发现，在采用相转化法制备nHA-PLGA复合材料的过程中，当nHA含量达30%时，复合物具有良好的理化性能，能增强体外矿化作用，促进细胞黏附、增殖和诱导分化，治疗骨组织缺损再生效果良好[55]。但有关nHA-PLGA复合时能最大化成骨的具体配比，目前仍不明确。

3.2 nHA-聚酰胺复合材料

聚酰胺（polyamide，PA）与人骨天然胶原结构和分子具有相似性，有良好的力学性能、生物可降解性，且无毒性。Wei等[56]采用共溶共沉淀法制备针状nHA-PA生物复合材料，nHA晶体可在复合材料中均匀分布（晶体直径为10～20 nm、长度为70～90 nm），复合材料孔隙率为80%，弹性模量为5.6 GPa，与天然骨相似，而生物陶瓷和医用金属的弹性模量则远高于天然骨。亦有研究表明，利用热诱导相变处理技术制备nHA-PA复合支架，引入MSCs后可极大程度地提高骨形成效率[57]。

研究者将通过注射成型法制备好的nHAPA66复合支架材料植入16只新西兰白兔的肌肉和胫骨中，2周后在多孔复合材料中检测到成骨，12周时新骨形成密度与周围宿主骨相似，提示复合材料诱导形成的新骨此时已达到正常骨质量[58]。在临床中采用nHA-PA66复合材料填充骨巨细胞瘤刮除术后遗留的骨缺损，随访结果表明术后1年植骨区骨密度接近正常骨密度，植骨材料与新生骨及周围组织结合紧密[59]。也正是由于nHA-PA材料具有良好的生物安全性、组织相容性以及优异的骨传导性和成骨活性，因此，其在临床骨缺损修复领域的应用前景非常广阔。

3.3 nHA-其他高分子聚合物复合材料

有学者通过熔融共混复合等工艺制备nHA-高密度聚乙烯复合人工骨材料，机械力学性能优异，可提高nHA的力学强度及韧性[60]。冯伟等[61]在兔节段性骨缺损模型中植入nHA-聚羟基磷酸戊酯/聚乙二醇复合材料，结果发现实验组生成新骨的强度明显高于单纯nHA骨缺损植入对照组，成骨能力良好。但此类材料目前多处于合成研究阶段，体内试验研究较少，安全性、稳定性及成骨性能均有待进一步研究。

4 总结与展望

nHA基复合材料是一种应用前景良好的骨组织工程生物材料，目前在骨缺损领域研究较多的是与壳聚糖、胶原、明胶、SF、PLA、PCL、PA等复合，这些材料与nHA复合后具有一定的机械支撑及成骨能力，但仍不能完全克服材料自身的缺点，因此目前有学者将关注点聚焦于nHA与多种材料的有效复合研究上，如在nHA-明胶微球中包埋基质细胞衍生因子-1、nHA和FeO纳米颗粒复合到壳聚糖/胶原（CS/COL）有机基质中制备磁性支架等[62-63]。nHA还可与无机材料及其众多细胞因子（转化生长因子β、骨形态发生蛋白、人成骨蛋白、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子等）结合以增强其成骨能力，满足临床修复骨缺损的各种需求[64-68]。此外，nHA基聚合物复合材料的细胞-材料相互作用、机械强度、生物性能及生物医学意义，也是未来的研究方向之一。