关节腔注射治疗骨关节炎载药体系的研究进展*

阮基浩 陈帅 范存义,2**

（1.上海交通大学附属第六人民医院骨科，上海 200233；2.上海健康医学院附属第六人民医院东院骨科，上海 201306）

骨关节炎是最常见的关节退变疾病，其病理变化包括滑膜炎症、软骨破坏、骨赘形成以及软骨下骨硬化[1,2]。目前，骨关节炎的治疗主要包括生活习惯调整、药物治疗以及针对疾病末期的手术治疗[3]。末期前的骨关节炎常推荐药物治疗，但是口服药物常有明显副作用。对于胃肠道不适或75岁以上老年患者[4]，关节腔药物注射是临床上一种非常有效的治疗方法[5,6]。然而关节腔注射的药物会被淋巴系统迅速清除，这极大地限制了该方法治疗骨关节炎的疗效[5,7]。所以在骨关节炎治疗中，最关键并最有临床应用前景的是设计并制备在关节腔内能够长期缓释的载药体系（drug delivery system,DDS）[8,9]，更高效持久地治疗骨关节炎。常用的载体根据形态分类包括水凝胶、聚合物以及纳米和微米颗粒，按照来源可分为天然生物材料、人工合成高分子材料和复合材料[10]。本文对目前骨关节炎关节腔药物注射治疗载药体系的研究进展作一综述，同时对药物靶向作用和载药分子大小进行讨论。

1 天然生物材料

天然生物材料抗原性较弱，具有良好的生物相容性，因此在药物输送体系中被广泛使用，其中最常用的有黏多糖（如透明质酸）、壳聚糖、胶原和明胶等[11]。天然生物材料通过物理或化学连接形成水凝胶（hydrogels），与细胞外基质一样含有丰富的水分，3D结构的水凝胶能够负载生物活性分子或细胞到靶点，通过水凝胶降解从而释放药物进行治疗[12]。同时水凝胶的关节腔注射治疗也被认为能够支持细胞生长、增殖、分化，促进软骨组织再生。

Kang 等[13]利用透明质酸水凝胶输送了聚乙二醇（poly-ethylene glycol,PEG）修饰的亲水Kartogenin（KGN），促进了软骨细胞生长，从而有效地治疗了骨关节炎。另外，Radhakrishnan等[14]制备了负载硫酸软骨素和透明质酸纳米颗粒的水凝胶，同时做到了两种成分半渗透的阶梯纳米支架，用于原位修复骨关节炎的骨软骨再生。Cai等[15]则利用透明质酸和壳聚糖按照7:3 比例铰链形成水凝胶，能够通过CD44 与软骨细胞靶向结合，并持续释放反义寡核苷酸进行基因沉默。在骨关节炎模型的软骨细胞中，第14 天环氧化酶2（cyclooxygenase-2,COX-2）含量与第3天和第10天相比，得到了更为有效的抑制。这表明骨关节炎中能够利用水凝胶进行基因治疗，且行之有效。

微球与纳米颗粒的出现为关节腔注射治疗提供了新的载药体系，这些颗粒不仅满足良好生物相容性和可降解的要求，并且能够修饰调控生物大分子的释放[10]。纳米颗粒已经在肿瘤临床治疗中显示出巨大优势，同样也被应用于骨关节炎的治疗中。与此同时，颗粒在合成过程中，常常通过蛋白质、脂质以及其他生物分子进行修饰，从而提高载药体系的疗效[5]。Zhu 等[16]研制了两相释放的壳聚糖微球，同时负载了靶向Rac1 抑制剂NSC23766。研究组证明了Rac1 的活化会促进软骨细胞分泌基质金属蛋白酶13（matrix metallo-peptidase-13,MMP-13）、ADAMTS-5 等基质金属蛋白酶，导致骨关节炎的发生和进展。同时，Rac1 抑制剂NSC23766 的快速-缓释两相释放，能够在软骨破坏的骨关节炎中起到有效的保护作用。

虽然天然材料有良好的生物相容性，但其存留关节腔的半衰期常相对较短[17,18]，例如水凝胶在生物组织内半衰期仅有1～2 d，这极大地限制了水凝胶的应用[19]。然而，骨关节炎的药物疗程常在数周到数月[3,20]，因此相对较短的存留时间也相应的限制了天然载体的发展和应用。

2 人工合成高分子材料

人工合成的高分子材料相较天然载体，则能够实现更长效的关节腔药物释放作用。聚乳酸（poly lactic-co-glycolic acid,PLGA）因其可靠的安全性、极低的毒性以及多变的物理化学特性而被广泛应用于多种临床研究。目前已有多个研究以PLGA 作为骨关节炎关节腔注射的载体，载有曲安奈德的PLGA微球在骨关节炎患者膝关节中存留了6周，非甾体抗炎药（nonsteroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs）氯诺昔康载入PLGA 后也同样提高了其在关节腔内的存留时间，并明显改善了治疗效果[10]。

Shkhyan等[21]将白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）受体亚单位gp130 的小分子配体RCGD 423 负载于PLGA，20 μg 的RCGD 423 能够维持浓度在0.1～0.3 μmol/L 并缓释12 d 以上，通过关节腔注射后，有效抑制了IL-6 引起的炎症反应，并减少了软骨细胞肥大凋亡，促进了软骨再生。然而，PLGA 载药体系仍旧存在一些不足，限制了它在临床的应用，例如药物有效包装率较低（约50%）、爆发式释放较高（约60%）以及回收率较低（约25%）等[22]。

Janssen 等[23]于是利用聚酰胺酯（polyester amide,PEA）制备了关节腔注射治疗的缓释微球。PEA聚合物中的氨基酸能够在丝氨酸蛋白酶作用下降解，从而释放非甾体类抗炎药塞来昔布。在中性粒样Hl-60细胞系中，塞来昔布在初始释放约15%后，缓慢释放长达80 d，为关节腔注射治疗提供了新的思路。然后研究人员离断了Lewis 大鼠前交叉同时切除部分内侧半月板构建了骨关节炎模型，关节腔注射治疗显示，负载塞来昔布的PEA 微球明显控制炎症并减缓软骨退化程度。

高分子材料不仅用于药物输送，本身也可以成为治疗性的替代品。在人体各关节中，关节腔的滑膜液在关节活动中起到了润滑的作用，但当剪切力较小且接触压力较大的情况下，滑膜液被挤出，继而主要由关节软骨表面的多糖和糖蛋白起到减小磨损的作用[24]。当骨关节炎发生，关节软骨表面的天然润滑层也遭到了破坏，进一步加重了疾病的进展[25]。Morgese 等[26]利用聚麸胺酸（polyglutamic acid back⁃bone,PGA）试图重建关节软骨表面的润滑功能。PGA 作为长链的主干，在两侧分别聚合了利用Schiff碱感应软骨退变的羟基苯甲醛（hydroxybenzalde⁃hyde,HBA）以及提供“毛刷”样润滑的聚-2-甲基-2-噁唑啉（poly-2-methyl-2-oxazoline,PMOXA）。研究发现，使用了聚合物修复的软骨表面明显降低了摩擦系数，提高了润滑性能。因此PGA-α-PMOXA（x）-β-HBA 有望成为早期骨关节炎的治疗药物，能够减少关节软骨的磨损。

3 复合材料

随着对生物材料的不断了解，复合材料越来越成为新兴的研究热点。相比于以上两类材料，它具有天然材料良好的组织相容性，又具有人工合成材料多变的可塑性和持久的缓释能力。Petit 等[22]将塞来昔布水凝胶载于甲基化处理的PCLA-PEG-PCLA“三明治”聚合物，并且通过凝胶温控实现了药物在关节腔内长达90 d 的缓释，为骨关节炎长期治疗提供了依据。水凝胶常被分为天然与合成两种，又可根据降解性分为可降解和非可降解。常用于关节软骨组织工程的聚合物是PEG、聚乙烯醇（poly-vinyl al⁃cohol,PVA）等[11]。Li 等[27]组装了混合水凝胶来治疗骨关节炎，混合了普朗尼克F127（聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物）、黏多糖和骨形态发生蛋白2（bone mor⁃phogenetic protein-2,BMP-2）的透明质酸水凝胶能够维持形态16 d以上，体内实验也验证了其抗炎作用。

糖皮质激素是临床常用的抗炎药物，但激素的长期、大剂量使用会导致严重的不良反应，包括高血糖、库欣综合征、骨质疏松症等。为了增加关节腔注射的地塞米松（dexamethasone,DEX）在炎症控制中的作用，Lee 等[28]利用碳纳米管（carbon nanotube,CNT）作为DEX 的关节内输送体系。DEX-CNT 药物输送体系能够增加小窝蛋白（caveolin）依赖的细胞内吞，从而在较低激素浓度下便有效控制促炎因子的释放，例如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）。值得注意的是，PEG 修饰的CNT 能够缓释地塞米松，增加纤维样滑膜细胞对小窝蛋白的内吞，修复线粒体，抑制活性氧反应，从而阻止关节病变。

4 药物靶向

理想的载药体系是能够精准地作用于病变或病变周围，既提高药物疗效又减少其副作用[10]。因此疾病靶向治疗日益成为研究的热点和重点。在骨关节炎的进展中伴随着软骨细胞外基质（extracellular ma⁃trix,ECM）的破坏，软骨细胞稳态改变，并造成局部炎症[29]。关节腔注射治疗中非靶向性的药物能够渗透到软骨的较少，同时容易被巨噬细胞吞噬或淋巴血液系统清除[30]。靶向软骨ECM 取决于载药体系进入并存留在基质胶原的能力。Whitmire 等[31]在自组装的纳米颗粒外负载了白细胞介素1受体拮抗剂（inter⁃leukin-1 receptor antagonist,IL-1Ra），活体成像显示药物在大鼠关节内可以存留14 d以上。

关节软骨从软骨面到骨面分为表层、切线层、中间层、深层以及钙化层5 层，其中切线层的软骨细胞在骨关节炎时有较为明显的破坏和变化，因此研究建议靶向该层软骨细胞进行药物治疗[5]。胶原是软骨ECM 的基本组成成分，不少研究针对胶原特异性靶向设计了抗关节炎药物载体。Rothenfluh等[32]在聚硫化丙烯纳米颗粒表面结合了Ⅱ型胶原α1 链结合肽，小鼠体内实验显示，直径38 nm 的靶向修饰纳米颗粒在软骨内的停留时间是相同直径对照组的71倍，也是直径96 nm 靶向修饰颗粒的14.9 倍。这些结果表明了生物分子靶向性和超小分子在ECM药物释放中的作用。

骨关节炎过程中伴随着软骨细胞表型的改变，微环境内合成了不同的代谢介质。基因治疗旨在针对调整软骨细胞表达从而阻断骨关节炎过程并恢复软骨稳态。阳离子聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）是非病毒基因治疗体系的重要一类，PEI将DNA输送到细胞质中释放，并整合到细胞核，从而达到基因治疗的效果[33]。Pi 等[34]通过健康兔滑膜与软骨的鉴别分析，筛选出软骨靶向多肽（CAP，序列：DWRVIIP⁃PRPSA），并连接在PEI的末端，从而构建了表达海参荧光素酶质粒的基因载药体系（CAP-PEI-DNA）。与非靶向性的对照颗粒相比，这些靶向软骨细胞的纳米颗粒表现了高出近乎一个数量级的转染效率。同样的CAP-PEI 体系也被用于输送Epas1 编码的低氧诱导因子2α（hypoxia-inducible factor-2α,Hif-2α）的siRNA，起干扰作用的载药体系（CAP-PEI-siRNA）通过关节腔注射用于骨关节炎模型小鼠。药物注射7 d后进行染色观察，可以发现CAP 偶联的颗粒较对照组软骨退化表现更轻，从而表明CAP-PEI 的载药体系可能成为骨关节炎基因治疗的突破点。然而注射CAP 载药体系的小鼠软骨退化程度依旧明显重于正常小鼠，很可能与CAP是从兔软骨细胞筛选有关，对小鼠软骨细胞缺乏足够的靶向性。

骨关节炎的炎症反应很大程度是由活化的巨噬细胞所引起，并形成了细胞内的活性氧。过量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）会外溢到细胞外基质中，从而破坏关节软骨的微环境[35]。Chung 等[36]设计了对ROS超敏反应的PLGA中空微球，在局部炎症环境的H2O2作用下，微球内的Fe2+和碳酸氢钠发生级联化学反应，从而产生CO2气泡破坏微球，达到释放微球内抗炎药物地塞米松的目的，继而保护破坏的软骨。体内外实验证明了ROS反应的微球能够很好地对生物反应相关的ROS 进行反应，并实现病灶特异性的药物输送。

5 载体的大小和输送

药物在关节腔减少的最主要屏障在于滑膜，药物从载体释放后发挥效用，最终被滑膜清除出关节腔[37]。而影响药物通过扩散作用到靶位点最关键的是细胞外基质，其中内皮细胞是蛋白质扩散的主要屏障[37]。因此在骨关节炎的关节腔注射治疗中，载体的大小决定着疗效的优劣。在ECM 被动靶向输送中，关节腔内纳米颗粒的分布主要由组织的渗透性和细胞内吞所决定。Rothenfluh等[32]通过生物筛选发现，直径在31～38 nm 的纳米颗粒能够进入关节软骨基质，而直径在96 nm的纳米颗粒无法进入。相对于被动的靶向作用，关节软骨积极主动的靶向作用则需要纳米颗粒具有球形结构，同时表面带有正电荷且直径小于软骨网状结构孔径（约60 nm）。而Lee等[28]发现PEG 修饰的CNT（PEG-SWCNTs）尽管表面是负电荷（在磷酸缓冲盐溶液中约-11 mV），但能够有很好的关节软骨渗透作用，很可能得益于其10 nm的直径以及1D结构。

在关节软骨胶原纤维中，有许多富含亮氨酸的蛋白聚糖（small leucine-rich proteoglycans,SLRPs）支链，它们与基质内表皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）、转化生长因子β（transforming growth fac⁃tor-β,TGF-β）、TNF-α等多种生长因子相互关联，成为动态调控软骨微环境的“蓄水池”[5]。因此纳米载药体系可以利用生物分子间的连接，将软骨基质从屏障阻碍转变为避免快速清除实现缓释的容器[32]。

6 总结和展望

作为全球性退变疾病，骨关节炎目前尚缺乏改善病情的抗骨关节炎药物（disease-modifying osteoar⁃thritis drugs,DMOADs）。虽然目前各类载药体系多处于基础研究阶段，距离临床应用尚有一定的距离，但其中一些已经进入了临床试验阶段。目前有二期临床试验来评价关节腔注射FX0006对骨关节炎的疗效[38,39]。FX006是一种新型的PLGA微球缓释系统，能够有效延长滑膜组织和滑膜液中药物作用时间。结果表明，膝关节炎患者在关节腔单次注射负载曲安奈德的FX006 载药系统后，在24 h 药物峰值后，能够持续20周在血浆中检测到曲安奈德。相比较于单纯曲安奈德组（1 ml，40 mg，n=18），使用FX006 载药体系的缓释系统能够有效降低血浆中曲安奈德峰值水平，从而减少药物的全身反应。关节腔药物注射在临床和基础研究中均体现了极大的治疗优势，是当前早期骨关节炎的有效治疗方法。小分子药物在关节腔内容易迅速被清除，所以临床治疗中常需要多次注射，且疗效有限[5,40]。因此，利用生物材料设计制备高效的DDS，将为基础研究转为临床治疗提供可靠渠道。

目前骨关节炎载药体系的生物材料研究主要包括生物安全性、可调控性、靶向性等，另外基础研究对生物分子的直径也有了更深入的了解，从而为载体的设计提供了指导意见[32]。Rothenfluh 等[32]提出可以将软骨基质的复杂3D 结构转变为DMOADs 的“水库”，从而有效提高骨关节炎的治疗效果，这为今后的研究提供了更开放的思维。总之，基于小分子和生物材料的载药体系是当前骨关节炎的研究热点，对载体和药物的修饰是靶向治疗的突破点。但目前的载药体系还不能满足全部需求，还存在各种难以避免的不足，如何使载药体系能够以更低剂量更加精准地治疗骨关节炎，如何做到药物的可控缓释，如何提高改善疾病进展的药物疗效，以及如何将载药体系转化于临床患者，将会成为今后的研究重点和热点。