成年商品猪大肠肠道菌群的计数与分析

■李 慧 杨大容 刘宝生

（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045）

动物肠道菌群与动物的生长及健康关系密切，成年动物肠道中长期定居着大约1014个微生物个体，是动物自身体细胞数量的十倍[1]。在这些微生物个体中，其中绝大部分是细菌。这些细菌按动物肠道内营养物质及微环境的不同而进行相对稳定的分布[2]，可以为宿主提供相当于自身拥有基因数量150倍以上的额外基因储备[3]。这些基因增强了动物自身的代谢能力，可为宿主合成机体必需的氨基酸、维生素，同时还可降解协助宿主从自身无法降解的非淀粉多糖中获得能量[4]。因此很多学者已经将动物肠道内的微生物菌群当作机体的一个重要的器官来看待[5]。

猪是畜牧业中提供肉食品的重要杂食性经济动物，同时也是研究人的肠道内生菌群的主要模型动物[6]。在过去的几十年间，虽然在猪肠道菌群的结构、功能及与宿主关系等多方面都开展了很好的研究[7-8]，但到目前为止，猪肠道内生菌群的真实状况却仍然不够清楚。本研究利用5种常用的培养基，通过对成年健康商品猪的大肠肠道不同区段内正常菌群的分离、计数，从而分析健康成年猪大肠肠道正常菌群的结构，同时也比较不同培养基对猪肠道菌群分离培养的效果。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

从江西省某大型生猪屠宰加工基地随机选择健康成年商品肉猪3头，鉴于菌群分离计数的工作量比较大，为避免肠道菌群在样品保存过程中产生明显变化，本研究的样品采集分3次独立进行，每次只采集1头猪的肠道内生菌群。采样时，利用生猪生产加工基地的生产设备和人员进行猪的屠宰，生猪宰杀完成后，完整地取出猪的整个肠道，置于冰盒中，迅速转运回实验室进行肠道菌群的采集。

在肠道菌群采集时，根据猪大肠的解剖学结构分为盲肠、结肠和直肠三段。同时根据每段肠段的长短不同，分别采集2、3、3个样品。在盲肠段，采样点分别为回盲口附近和盲肠的盲端顶端，结肠段为降部中段、圆锥顶部和升部中段，直肠段则在前、中、后部分别采集残留在直肠中的粪便。无菌操作，分别从各采样点采集20～30 g的肠内容物至事先已灭过菌的50 ml离心管中，盲肠部分的样品分别标记为M1、M2，结肠部分的样品分别标记为J1～J3，直肠部分的样品标记为Z1～Z3。所有样品均加盖密封，然后置于4℃冰箱中保存备用。

1.2 培养基的制备

本试验共选用了5种常用的非选择性培养基：PCA（plate count agar）、NA（nutrient agar）、TSA（tryptic soy agar）、LB 营养琼脂（Luria-Bertani nutrient agar）和 标 准 Ⅰ号 琼脂（standard I nutrient agar，StdI）。按培养基（配方组成见表1）的制备操作说明，分别用直径为9 cm的一次性无菌培养皿制备好相应的琼脂平板，备用。

表1 五种常用非选择性培养基的配方(g/l)

1.3 肠道菌群的分离与培养

1.3.1 样品的前处理

从4℃冰柜中取出事先采集并保存的猪肠道各肠段样品，准确称量并记录装有目标肠段样品的试管总重量。无菌操作，用灭菌后的不锈钢干净药勺移取目标肠段样品约1 g，转入一个15 ml的离心管中，用灭菌生理盐水进行10倍稀释，然后将离心管置于旋涡振荡器上高速振荡5～10 min。为尽可能地避免因为储存而导致的样品中菌群数量的减少，每次采集的样品必须在3 d内完成菌群的分离与培养。

1.3.2 样品的十倍梯度稀释

无菌操作，用灭菌生理盐水，将充分混匀震散的肠道菌群按10倍梯度稀释法依次制备成最适涂板计数的三个连续梯度稀释液。根据预备试验的结果，不同肠段样品的三个最适连续稀释梯度依次选择为：盲肠 10-5、10-6、10-7，结肠 10-7、10-8、10-9，直肠10-7、10-8、10-9。

1.3.3 肠道菌群的培养

本试验采用平板涂布法对样品中的菌群进行分离培养，五种不同的培养基分别同时接种相同的三个连续梯度稀释液。无菌操作，用移液器移取各样品的连续梯度稀释液100 μl于事先制备并标记好的培养基平板中央，用玻璃涂抹棒将菌液在整个平板表面涂抹均匀，每一样品同一稀释度每次涂布两个平行平板。将涂布好后吸收完全的平板转移至37℃的培养箱中倒置培养18～24 h，待其长成清晰而又不互相粘连的菌落时即可开始进行菌落计数。

1.3.4 菌落计数

根据菌群分离的效果，选取菌落数在30～300个之间的平板进行计数，对同一类型的粘连菌落只计数一次，不同类型的重叠菌落单独计数。每一样品每个稀释度的最终菌落数为两个平行平板的平均值。

1.4 数据处理

不同肠段或采样点之间菌群数量的差异，以及不同培养基对肠道菌群计数效果的差异均采用SAS 9.4的ANOVA或GLM过程进行方差分析，当P＜0.05时，表示差异显著。

2 结果

2.1 不同肠段的菌群计数结果

按菌落计数的规则，从连续梯度平板中，选择平行性好，菌落数在30～300个之间的平板进行菌落计数。不同培养基对各肠段不同采样点菌群计数的结果见表2。

表2 五种培养基对成年猪大肠不同肠段菌群计数结果[lg(cfu)/g]

从表2可以看出，从回盲口（M1）到直肠前段（Z1），随着采样位点的向后延伸，肠道内生菌群活菌数量呈现递增趋势，但经SAS 9.4的ANOVA过程统计分析的结果表明，除LB培养基的结肠J3位点及直肠Z1、Z3位点的活菌数显著（P＜0.05）高于盲肠的M1位点外，其余各肠段采样点间活菌数量均无显著差异（P＞0.05）。试验中所用到的其他4种培养基对猪大肠中不同位点菌群的活菌计数结果均未呈现显著性差异（P＞0.05）。

从上述各肠段不同位点的活菌计数结果来看，盲肠的M1与M2位点，结肠的J1、J2与J3位点，以及直肠的Z1、Z2、Z3三个位点在五种不同的培养基中，菌群计数结果均显示差异不显著（P＞0.05）。这一结果说明在成年猪同一肠段的不同位点之间，其菌群的活菌数量没有明显差异。因此，我们可以将盲肠、结肠和直肠内的不同位点之间的样品计数结果进行合并分析，从而可以得出不同培养基对成年商品猪盲肠、结肠和直肠内菌群的计数结果（见表3）。合并后的数据采用SAS 9.4的GLM过程进行组间方差显著性检验，差异显著性水平仍为P=0.05。

表3 不同培养基对猪大肠段的活菌计数结果[lg(cfu)/g]

从表3中可以看出，5种培养基中，NA、PCA两种培养计数所得结果盲肠、结肠和直肠之间没有明显区别（P＞0.05），而培养基LB、TSA和StdI的培养结果则显示出直肠内的固有菌群数量明显比盲肠多（P＜0.05）。有趣的是，在所有的5种培养基中，结肠内活菌的计数结果均与盲肠和直肠无显著性差异（P＞0.05），这从一个方面说明了结肠不仅在结构上是盲肠向直肠的过渡，而且在肠道内生菌群数量上，也具有过渡的特征。

2.2 不同培养基对猪肠道菌群计数的影响

本试验选用5种实验室常用的非选择性培养基对猪大肠不同位点的内生菌群进行活菌计数的结果见表2。经SAS统计分析，结果表明5种培养基对猪大肠相同位点样品的菌群活菌计数结果均不存在显著性差异（P＞0.05）。但从表3合并后分析的数据结果来看，培养基NA、PCA检测的结果要比LB、TSA和StdI的稍低。因此，如果从最大限度地培养肠道菌群数量的角度出发，培养基LB、TSA和StdI的效果要比NA和PCA好。

3 讨论

3.1 成年商品猪大肠不同肠段肠道可培养菌群的分布

在动物肠道内，不同肠段因为其功能不同，肠内容物的组成和性状差异很大，因此，肠内容物中微生物的种类和数量也不可能完全一样。在本试验中，因为五种不同培养基对同一位点的菌群计数结果无显著性差异（P＞0.05，见表2），因此，我们可将同一肠段不同培养基的计数结果取平均值作为该肠段的检测值，进一步分析各肠段间菌群数量的关系。结果表明，在猪的大肠中，从盲肠到直肠，整个肠段的内生菌群数量沿肠管的延续方向向后逐渐增加，盲肠、结肠和直肠之间，其内生菌群的数量均具有显著性差异（P＜0.05，见表4）。Butine等[9]曾对生长肥育猪盲肠和结肠的厌氧菌群进行活菌计数，结果同样表明结肠内的活菌数量显著高于盲肠。

表4 猪大肠不同肠段间的活菌计数统计分析[lg(cfu)/g]

3.2 不同培养基对猪肠道菌群分离培养的影响

不同的培养基配方，因为其营养组成成分的差异性，必然会对所培养的菌群具有一定的选择性。本试验的结果表现为：不同培养基对猪肠道同一位点菌群的活菌计数结果可能不同。在用LB培养基进行活菌计数时，J3、Z1和Z3的菌群数量明显要比M1多（P＜0.05），而其他四种培养基虽然都存在顺着肠道的延续，从前至后菌群数量逐渐增加的趋势，但未呈现显著性差异（P＞0.05）。

4 结论

本试验利用5种实验室常用的非选择性培养基对成年商品猪大肠内8个位点的内容物进行了活菌计数，结果表明从盲肠、结肠到直肠，肠道内生菌群的数量沿肠道向后依次显著增加（P＜0.05），同时，在盲肠、结肠和直肠的同一节段内，不同位点的菌群数量差异不显著（P＞0.05），即同一节段之间菌群活菌数量相似。本试验的结果可为进一步研究饲料中不同添加剂对猪肠道正常菌群的影响提供依据。