液质联用法监测玉屏风颗粒原药材的投料分析研究

罗华玲，王小林，朱敏凤，冯想，袁茂华，黎小虎，林海霞

(乐山市食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000)

玉屏风为中医扶正固表的传统名方，其颗粒剂由黄芪、防风、白术(炒)三味药组成，具有益气、固表、止汗之功效，主要用于表虚不固，自汗恶风，面色晄白，或体虚易感风邪者。玉屏风颗粒为国家中药保护品种，收载于《中国药典》2015年版一部[1]。根据中医药理论及方解，中药复方制剂是依据君臣佐使的原则组方给药，其疗效是各味药综合作用的体现。在本方中黄芪重用益气固表，实卫止汗，为君药；白术健脾益气，助黄芪益气固表，为臣药；防风走表而御风邪，为佐药。玉屏风颗粒质量标准中仅以黄芪的主要有效成分黄芪甲苷作为质量控制指标，难以全面控制复方制剂的质量。那么某些制药厂为了提高自己市场竞争力，会降低其生产成本，利用质量标准的不完善，在生产中会少投或不投某些药材，或直接加入质量标准中有质控的有效成分，那么这些药品，虽然没有按生产工艺投料生产，担按质量标准检验却还是合格。这就造成质量不同的玉屏风颗粒价格高低不一，扰乱市场，同时也不能确保人民群众用药的安全性和有效性[2]。经查阅文献，国内外对玉屏风颗粒有效成分(黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷)的检测方法报道并不多见，主要的测定方法有 RP-HPLC(反相高效液相色谱法)[3-4]、HPLC-ELSD(高效液相-蒸发光散射检测)[5]、UV(紫外可见分光光度法)[6]、UPLC(超高效液相色谱法)[7]，但都仅以一、两种有效成分作为监测对象，未见有全面测定玉屏风颗粒中各有效成分(黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷)含量的报道，更无应用HPLC-MS/MS法全面监测玉屏风颗粒中原药材(黄芪、防风、白术)投料情况的报道。

因此本实验从监测制药厂家生产的中成药是否按工艺投料方面着手，以中成药玉屏风颗粒为研究对象，应用HPLC-MS/MS检测方法，测得混合对照药材(黄芪、防风、白术)、对照品(黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷)、市售玉屏风颗粒样品的一级质谱图及二级质谱图，选取各自的特征峰进行对比分析，即可监测玉屏风颗粒中原药材(黄芪、防风、白术)的投料情况；通过测得的HPLC-MS/MS色谱峰面积，可同时对质控成分(黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷)进行准确定量。该方法能更全面、快捷地监控玉屏风颗粒的投料情况及质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

SIL-20AHT型高效液相色谱仪-API3200型质谱仪(高效液相色谱串联质谱仪，配有电喷雾离子源，美国AB SCIEX公司)；数据处理软件analyst Software(版本1.4.2Build1465，美国AB SCIEX公司)；电子天平(mettle toledo)；KQ-700DE数控超声波清洗器(上海跃进医用光用器械厂)。

1.2 材料

黄芪甲苷(中国食品药品检定研究院，批号：110781-201616，纯度：97.4%)；白术内酯Ⅲ(中国食品药品检定研究院，批号111978-201501，纯度：99.9%)；升麻苷(中国食品药品检定研究院，批号：111522-201511，纯度94.8%)；黄芪(蒙古黄芪，中国食品药品检定研究院，批号：120974-201311)；白术(中国食品药品检定研究院，批号 120925-201109)；升麻(兴安升麻，中国食品药品检定研究院，批号：121182-201102)；玉屏风颗粒(市售药品，广东环球制药有限公司，批号分别为 170101、160608、160318，规格为5g/袋×12袋/盒)。甲醇、乙醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯化水。

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱Inertsil ODS-3，(2.1 mm×150 mm×5 μm)；流速为0.4 mL/min；进样量为10 μL；体积流量为0.2 mL/min；流动相以甲醇(A)-10 mmol/L醋酸铵(B)溶液,梯度洗脱(0～3 min，5%A；3～4 min,5%～95%A； 4～10 min,95%A；10～15 min,95%～5%A；15.01 min,stop)。

2.1.2 质谱条件

电喷雾ESI离子源；扫描方式：负离子；检测方式：多反应定性(定量)监测；负极电离；气帘气流速为30 L/min；碰撞气流速为3 L/min；毛细管电压为-5 500 V；干燥气温度为450℃；加热电离辅助气流速为30 L/min；加热电离辅助气流速为30 L/min；检测器采用负离子检测，扫描方式采用全扫描一级质谱、全扫描二级质谱，质荷比范围100～1 000。黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷质谱分析的条件参数见表1。

表1 黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷质谱分析的条件参数

2.2 对照提取物及对照品溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制

精密称取黄芪甲苷11.26 mg(含量以97.4%计)，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得黄芪甲苷对照品溶液109.67 μg/mL；精密称取白术内酯Ⅲ 10.45 mg(含量以99.9%计)，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，得白术内酯Ⅲ对照品溶液104.40 μg/mL；精密称取升麻苷11.21 mg(含量以94.8%计)，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，得升麻苷对照品溶液106.27 μg/mL。

混合对照品溶液：精密量取黄芪甲苷对照品溶液1 mL，白术内酯Ⅲ对照品溶液1 mL,升麻苷对照品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。黄芪甲苷对照品溶液浓度为1.10 μg/mL，白术内酯Ⅲ对照品溶液1.04 μg/mL，升麻苷对照品溶液1.06 μg/mL。

2.2.2 对照药材溶液的配制

精密称取黄芪药材3.045 1 g，加水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，滤过，滤液浓缩至适量，加乙醇至含醇量为70%，搅拌，静置，滤过，滤液减压浓缩至约1 mL，加甲醇使溶解并转移至200 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取此溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

精密称取白术药材1.041 9 g，加水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，滤过，滤液浓缩至适量，加乙醇至含醇量为70%，搅拌，静置，滤过，滤液减压浓缩至约1 mL，加甲醇使溶解并转移至200 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取此溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

精密称取防风药材1.065 3 g，提取挥发油，蒸馏后水溶液浓缩至约1 mL，挥发油及浓缩水溶液置200 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度；精密量取此溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取玉屏风颗粒，研成细粉，精密称定约2.5 g，置索氏提取器中，加甲醇180 mL，加热回流至提取液无色(约6 h)，提取液过滤至200 mL量瓶中，用甲醇多次洗涤药粉，并入量瓶中，用甲醇定容至刻度；取上述溶液5 mL置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，即得。

按上述色谱及质谱条件，将黄芪对照药材、白术对照药材、防风对照药材、玉屏风颗粒、混合对照品(黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷对照品)进行测定，记录一级质谱图(图1、图2)、HPLC-MS/MS色谱图(图3)。由图1、图2及图3可知玉屏风颗粒中各组分峰型良好，本方法具有较好的分离度和灵敏度，可以进行定量分析。

注：A:黄芪对照药材;B：白术对照药材；C:防风对照药材;D:玉屏风颗粒图1 黄芪对照药材,白术对照药材,防风对照药材,玉屏风颗粒的一级质谱图

注：E：黄芪甲苷 (785.8/143.5 amu)、F：白术内酯Ⅲ(249.2/231.8 amu)、G：升麻苷(469.5/308.0 amu)图2 混合对照品(黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷)一级质谱图

图3 黄芪甲苷，白术内酯Ⅲ，升麻苷对照品的HPLC-MS/MS色谱图

从对照品一级质谱图上可看出，黄芪甲苷的特征峰为785.8；白术内酯Ⅲ的特征峰为231.4、249.4；升麻苷的特征峰为469.5。黄芪对照药材的特征峰为177.3、360.3、381.1、458.4、475.3、679.9、785.8；白术对照药材的特征峰为135.4、161.4、163.8、185.7、231.7、249.9；防风对照药材的特征峰为266.2、291.4、307.4、453.4、469.4、491.3；混合对照品的特征峰为231.4、249.4、469.5、587.5、785.8。

在市售玉屏风颗粒一级质谱图的特征峰：116.1、175.3、249.3、381.1、469.4、785.6，可以看到市售玉屏风颗粒与黄芪对照药材、白术对照药材、防风对照药材、混合对照品(黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷)的一级质谱图有相应的特征峰，由此可判断，市售玉屏风颗粒按原药材(黄芪、白术、防风)投料，即可确定该中成药按生产工艺投料。

2.4 方法验证

2.4.1 专属性

分别取上述对照品溶液、供试品溶液与溶剂空白，采用HPLC-MS/MS法测定，供试品溶液总离子流色谱图中待测峰的出峰位置处未见干扰峰，专属性良好。

2.4.2 线性关系试验

标准曲线对照品溶液的制备：精密量取黄芪甲苷对照品溶液(109.67 μg/mL)(2.2项)5 mL置50 mL棕色量瓶中，定容到刻度，取上述溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、6 mL置100 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线对照品溶液。照上述色谱、质谱条件，分别吸取10 μL注入液质联用仪，记录色谱图，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X(μg/mL)为横坐标，经线性回归，得线性回归方程y=1.85e+004x-69.7(r=0.999 5)，结果表明在0.105～0.628 μg/mL呈良好线性关系。

精密量取白术内酯Ⅲ对照品溶液(104.40 μg/mL)5 mL置50 mL棕色量瓶中，定容到刻度，取上述溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、6 mL置100 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线对照品溶液。照上述色谱、质谱条件，分别吸取10μL注入液质联用仪，记录色谱图，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X(μg/mL)为横坐标，经线性回归，得线性回归方程y=1.74e+006x+1.36e+003(r=0.999 9)，结果表明在0.104～0.626 μg/mL呈良好线性关系。

精密量取升麻苷对照品溶液(106.27 μg/mL)0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、3 mL置100 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线对照品溶液。照上述色谱、质谱条件，分别吸取10 μL注入液质联用仪，记录色谱图，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X(μg/mL)为横坐标，经线性回归，得线性回归方程y=6.16e+004x+3.95e+003(r=0.998 8)，结果表明在0.531～3.19 μg/mL呈良好线性关系。

2.4.3 精密度试验

取混合对照品溶液，照上述色谱、质谱条件，分别吸取10 μL注入液质联用仪，按“2.1分析条件” ，平行测定6次，记录色谱图各对照品的峰面积，并计算得黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷色谱峰面积的RSD分别为0.56%，0.80%，1.10%。

2.4.4 重复性试验

取同一批号玉屏风颗粒颗粒(批号为170101)6份，按“2.3”项方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1分析条件”测定3个有效成分峰面积，计算样品中黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷的含量，其含量的RSD分别为1.1%、0.9%、1.6%。

2.4.5 稳定性试验

取玉屏风颗粒颗粒(批号为170101)1份，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1分析条件”测定，分别于 0，2，4，8，12，24 h进行测定分析，以色谱峰面积计算，结果黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷峰面积的RSD分别为0.9%、1.2%、2.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定; 将同一供试品溶液置于4 ℃冰箱中，每日进样1次，连续测定5 d，以峰面积计算，结果黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷峰面积的RSD分别为1.8%、1.7%、2.5%。

2.4.6 加样回收试验

精密称取黄芪甲苷12.05 mg(含量以97.4%计)，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得黄芪甲苷对照品溶液1.173 7 mg/mL；精密称取白术内酯Ⅲ16.85 mg(含量以99.9%计)，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，得白术内酯Ⅲ对照品溶液0.673 3 mg/mL；精密称取升麻苷26.73 mg(含量以94.8%计)，置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，得升麻苷对照品溶液5.068 0 mg/mL。

取玉屏风颗粒(批号为170101)9份，三份为一组，研成细粉，分别精密称取约1.2 g，置索氏提取器中，每组分别精密加入上述黄芪甲苷对照品溶液(1.173 7 mg/mL)、白术内酯Ⅲ对照品溶液(0.673 3 mg/mL)、升麻苷对照品(5.068 0 mg/mL)0.8 mL、1 mL、1.2 mL各三份；加甲醇180 mL，加热回流至提取液无色，提取液过滤至200 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度；取上述溶液5 mL置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，即得。黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷平均回收率分别为90.77%，93.25%, 94.26%(n=9)。玉屏风颗粒中黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷回收率结果见表2。

2.5 样品测定

取3批次玉屏风颗粒(1.2项)照(2.3项)制备方法制备供试品溶液，按“2.1分析条件”测定三种有效成分的峰面积，每批重复测定 3 次，按回归方程计算黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷的含量，结果见表3。

2015年版《中国药典》规定每袋玉屏风颗粒含黄芪以黄芪甲苷计，不得少于3.5 mg，未对其余两成分作规定。根据表3结果，可知3批次样品的黄芪甲苷含量符合标准规定。

表2 玉屏风颗粒中黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷回收率试验结果

表3 玉屏风颗粒中黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ、升麻苷的含量测定结果(n=3)

3 讨论

玉屏风颗粒是由黄芪、白术、防风制成的复方制剂，中药复方是依据君臣佐使的原则组方给药，中药复方的疗效是各味药综合作用的体现，本制剂中的主要药效指标成分为黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ和升麻苷，而《中国药典》单以一味药(黄芪)为质控标准来衡量，难以全面控制复方的质量。本文应用HPLC-MS/MS方法建立了同时检测玉屏风颗粒中黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ和升麻苷的定量测定方法，流动相以甲醇-10 mmol/L醋酸铵溶液按梯度程序洗脱，体积流量为0.4 mL/min，各成分得到较好的分离，且保留时间适当。

本实验采用HPLC-MS/MS方法监测原药材投料情况及同时测定主要药效指标成分(黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ和升麻苷)的含量。本方法可同时进行样品前处理及各有效成分的含量测定，在人力物力上节约了时间和成本；且通过测得原药材(黄芪、白术、防风)、主要药效指标成分(黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ和升麻苷)、及市售玉屏风颗粒的一级质谱图及二级质谱图，选取各自的特征峰进行对比分析，可判断该药品生产时是否按工艺投料，即可全面监测原药材的投料情况；将样品的色谱峰面积代入指标成分(黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ和升麻苷)的线性方程中，可准确计算出玉屏风颗粒中有效指标成分黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ和升麻苷的含量。

研究结果显示：含量测定的方法学考察均符合要求，该方法成本低、快速简便、精密度好、科学合理、灵敏度高，可全面监测和控制原药材的投料情况，可准确地测定出玉屏风颗粒中黄芪甲苷、白术内酯Ⅲ和升麻苷的含量，并为含黄芪、白术、防风制剂质量标准的提高研究提供参考依据；此方法不仅为玉屏风颗粒的质量控制提供了参考和依据，同时为下一步研究玉屏风颗粒的药动学奠定了一定基础。