川芎嗪通过抗氧化及抗炎作用改善脊髓损伤

都芳涛，方继峰，李兴晶，乔培柳，李广义

(山东泰山医学院附属聊城市第二人民医院骨外科，山东 临清 252600)

脊髓损伤可导致四肢及躯体受损部位功能障碍，导致严重并发症，包括骨髓水肿与受损部位的细胞凋亡，甚至终生残疾及死亡[1]，这种损伤包括急性损伤与二次损伤。急性脊髓损伤可导致脊髓部分或全部破裂[2-3]。原发性脊髓损伤可降解关键的细胞骨架及活性功能蛋白，导致病变部位及其周围神经元与胶质细胞的迟发性死亡[4-5]。原发性损伤是机械损伤，是不可避免的[6]，而二次损伤可通过干预进行避免[7]。大量研究都致力于了解脊髓二次损伤的机理，以达到开发出可以改善甚至是逆转脊髓损伤的治疗方法。川芎嗪是中药川芎中的生物碱，有扩张血管、抑制血小板聚集的作用[8]。研究发现川芎嗪可以减轻脑损伤、促进神经功能恢复[9]。另外，川芎嗪可以抑制淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润及促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的表达，降低炎症相关的信号分子和细胞核因子κB的活性，促进缺血神经元和巨噬细胞/小胶质细胞内核因子E2 、相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)的表达，发挥抗炎和神经保护作用。然而，川芎嗪针对脊髓损伤的作用机理大部分处于未知状态。本研究主要是通过对照研究川芎嗪对脊髓损伤的保护作用，结果发现川芎嗪可能通过提高Nrf2-GCLc/GCLm信号通路促进脊髓损伤的康复，从而改善氧化应激及炎症反应，促进脊髓功能的恢复。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2017年1月—2018年5月在我院治疗的90例脊髓损伤患者，46名男性和44名女性；年龄45～67岁，平均(55.56±9.54)岁。分为对照组、高剂量川芎嗪组和低剂量川芎嗪组，平均每组30人，两组间性别、年龄无差异(P>0.05)。见表1。

表1 患者一般情况比较

1.2 分组与给药

对照组患者在治疗过程中静脉滴注250 mL 0.9%氯化钠注射液，连续静滴14 d。高剂量川芎嗪组病例静脉滴注250 mL 0.9%氯化钠注射液+240 mg川芎嗪，连续静滴14 d。低剂量川芎嗪组病例静脉滴注250 mL 0.9%氯化钠注射液+120 mg川芎嗪，连续静滴14 d。

1.3 实时定量PCR

患者静脉滴注疗程结束后进行腰椎穿刺抽取脑脊液进行检测，根据厂家说明书(天根生化科技北京有限公司)，采用Trizol法提取总RNA。并对cDNA进行逆转录，而后采用实时定量PCR进行样品分析(BIORAD CFX96实时平台，SYBR Premix Ex TaqTM II)。基因的表达归一化到β-肌动蛋白水平，并采用2-△△Ct进行对比分析。

1.4 促炎性细胞因子的生化检测

抽取患者脑脊液后根据厂家的说明书，采用酶联免疫试剂盒测定其中的IL-1β、TNF-α、Nrf2及GCLc与GCLm的含量(BioVision公司)。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 川芎嗪对炎症反应的作用

炎症反应与脊髓损伤的病情发展密切相关，研究显示抗炎作用能改善脊髓损伤[10-12]。本次研究中，我们评估了川芎嗪对脊髓损伤患者体内炎症的作用。如表2所示，与对照组患者相比，给予川芎嗪静滴的脊髓损伤患者的脑脊液中的TNF-α与IL-1β的mRNA表达明显降低。

表2 川芎嗪对TNF-α和IL-1β含量的影响

2.2 川芎嗪对氧化应激反应主要调节因子的作用

脊髓损伤患者体内Nrf2(一种重要的氧化还原控制因子)的mRNA表达显著降低。摄入川芎嗪可以显著抑制脊髓损伤患者体内Nrf2的表达降低。另外，GCLc与GCLm的mRNA表达在挫伤性脊髓损伤后显著下调。川芎嗪可以显著上调GCLc与GCLm的mRNA表达。见表3。

表3 川芎嗪对Nrf2、GCLc、GCLm含量的影响

3 讨论

川芎嗪主要成分为2，3，5，6-四甲基吡嗪，是从川芎根茎中提取分离的生物碱单体，有促进神经功能恢复，减轻脑损伤的作用[10]，该物质可能存在保护神经及促进神经元再生的作用，但目前关于川芎嗪对脊髓损伤后神经元再生的作用机理的研究较少。此次研究中，我们抽取脊髓损伤患者脑脊液进行实时定量PCR测定和促炎性细胞因子的生化检测，以此评估川芎嗪对脊髓损伤恢复作用过程中抗氧化及抗炎症活性的作用。

炎症反应与脊髓损伤的病情发展密切相关，降低炎症反应可以改善脊髓损伤，促进脊髓的恢复[11-12]。有研究表明，脊髓损伤后IL-1β含量上升是慢性损伤的重要信号[13]。脊髓损伤的炎症反应与TNF-α相关联，其表达下调可以促进脊髓损伤的修复[14-15]。研究发现川芎嗪可抑制脊髓损伤过程中炎性反应，主要通过IL-1β与TNF-α的表达反映出来。先前研究表明川芎嗪可以抑制大鼠急性损伤后脊髓组织中巨噬细胞移动抑制因子、NF-Kβ及IL-1β的表达，阻止白细胞的浸润，促进NF-Kβ抑制蛋白和抗炎细胞因子IL-10的表达，达到减轻急性脊髓损伤后炎症反应的目的[11]。川芎嗪还能抑制脊髓损伤小鼠脊髓组织TNF-α、IL-1β和COX-2的mRNA的表达，调节小胶质细胞的活化，抑制小胶质细胞活化和中性粒细胞浸润，延迟脊髓继发性损伤和保护脊髓[9]。川芎嗪无论剂量大小均可降低脑缺血组织中EDI、IL-1β和TNF-α的表达，抑制缺血区的炎症反应，进而保护脑组织[16]。结合以上结果我们发现，川芎嗪的抗炎作用可能与脊髓损伤的恢复有关。在本研究中，通过利用在治疗脊髓损伤患者过程中静滴川芎嗪探讨患者脑脊液中炎性因子的表达中发现，脊髓损伤患者在给予静滴川芎嗪后TNF-α和IL-1β的表达明显下降，川芎嗪对于减轻脊髓损伤具有重要作用。

氧化应激反应可以影响脊髓损伤的发病及发展[17]。川芎嗪通过抗氧化、抗凋亡等途径对脑组织进行保护。实验研究发现[18]，川芎嗪可通过提高核因子E2相关因子2(Nrf2)和谷氨酰半胱氨酸链接酶(GCLc)的蛋白表达，促进谷胱甘肽的合成，降低ROS水平，阻断细胞凋亡，恢复线粒体功能，改善氯化钴诱导的氧化应激和脑神经损伤，达到保护脑神经的作用。川芎嗪还可提高Nrf2和GCLc的表达抑制MPTP诱导的大鼠大脑黑质氧化应激损伤[19]。与既往研究不同，此次研究通过针对脊髓损伤患者治疗过程中静滴川芎嗪，抽取脑脊液测定相关因子的PCR表达，发现氧化应激相关因子，例如Nrf2、GCLc、GCLm的mRNA表达明显增加，大剂量应用川芎嗪的脊髓损伤患者增加更为明显，成正相关性，这说明川芎嗪对于脊髓损伤患者的氧化应激反应有重要作用，这对于以后在临床上应用川芎嗪治疗脊髓损伤患者提供了新的方向。

另外，临床药理实验证明，川芎嗪具有抗血小板聚集作用，可改善微循环，抗氧化、抗纤维化和拮抗Ca2+内流，进而扩张血管、改善微循环，保护血管内皮细胞[20-23]。动物实验研究表明，川芎嗪可降低缺血再灌注后大脑皮质肿瘤坏死因子-α含量和髓过氧化物酶活性，减轻炎症反应，保护脑缺血大鼠的脑神经[24]。此次研究我们进一步验证：川芎嗪可改善氧化应激反应及炎症反应，降低脊髓损伤，促进脊髓损伤患者的恢复，这些结果为川芎嗪治疗相关的脊髓损伤与神经退行性疾病提供了新的视角。