胃癌、结肠直肠癌血清标志物在疾病筛查、诊断中的应用新进展

陈 平， 吴云林

（上海交通大学医学院附属瑞金医院北院消化内科，上海 201801）

现有的数据显示，我国的胃癌发病率达31．28/10万，并有30%的胃癌患者为伴有远处转移的晚期胃癌，该类患者接受治疗后的 5年生存率不足10%；而结肠直肠癌发病率为 27．47/10万，占全部恶性肿瘤新发病例的 9．60%，死亡率为 13．27/10，占全部恶性肿瘤死亡病例的 7．65%。可见，我国胃癌、结肠直肠癌的发病率及死亡率仍处于较高水平。究其原因，是由于诊断胃癌、结肠直肠癌和判断其预后的标志物如癌胚抗原（carcino-embryonic antigen,CEA）、 糖类抗原19-9 （carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）和CA724等的灵敏度和特异度较低，同时因消化道内镜检查等侵入性操作临床应用难度较大，故对低侵入性或非侵入性检测的需求非常大，迫切需要寻找高特异度和灵敏度的生物标志物，如传统血清肿瘤标记物的组合、循环肿瘤细胞、微小RNA、环状RNA、循环肿瘤DNA和细胞因子等，以用于筛查和诊断。本文将对近年来发现的胃癌、结肠直肠癌标志物进行介绍，为胃癌及结肠直肠癌的早期诊断提供新的思路。

传统胃、结肠直肠血清肿瘤标志物

一、应用于筛查

某些癌症患者的血液中可出现CEA和CA19-9水平升高，尤其是结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌或肺癌，因此，临床上常将其作为筛查肿瘤的指标之一。

二、应用于预后

传统的血清胃癌、结肠直肠肿瘤血清标志物不仅可应用于筛查胃肠道肿瘤，近年研究提示，其还可用于判断术后及治疗后的预后判断。

1．术后无病生存期及转移：近期，Suenaga等[1]收集，998例胃癌Ⅱ期及Ⅲ期根治性切除术患者的临床资料，评估其术前、术后的CEA、CA19-9水平以及两者结合的水平、时间变化对预后的影响，结果发现，患者术后的CEA、CA19-9水平呈逐步下降，而其无病生存率与术后CEA、CA19-9水平相关，两者水平均较高的患者，其预后明显差于水平低的患者，术前和术后血清CEA （＞5 ng/mL）、CA19-9水平（＞37 IU/mL）都高的患者随访4年内的无病生存率最低。患者术后CEA水平高与肝、肺、骨转移发生率增高显著相关，而术后CA19-9水平高则与淋巴结、肝转移发生率增高显著相关。

2．化疗后疾病进展及预测化疗疗效：相对于高CEA水平对辅助化疗患者的预后判断价值，其对单纯手术患者更有预测价值，而高CA19-9水平对辅助化疗患者的预后判断价值更大。在结肠直肠癌患者中，手术治疗前、后的血清CEA水平升高与其肿瘤局部浸润程度加深、隐匿性转移风险升高、手术治疗后复发率升高相关，但其诊断灵敏度的问题仍有待解决。有研究揭示，短暂的CEA水平激增可见于接受奥沙利铂等化疗的结肠直肠癌患者，提示CEA水平可能并不能准确指导结肠直肠癌患者的治疗方案。由此，2006年美国临床肿瘤学会最新建议指出，在给予奥沙利铂等药物治疗的最初4～6周，患者CEA水平升高时应谨慎判断。但有研究在评估西妥昔单抗联合化疗周期中发现，CEA、CA19-9较基线水平一过性升高以及随后的降低与疾病的无进展生存期密切相关，表现为接受西妥昔单抗联合化疗后1个周期，如果CEA下降60%和CA19-9下降45%的患者，无进展生存期更长（分别为11.13个月和8.10个月）。认为CEA和CA19-9有助于评估西妥昔单抗的耐药性，并可作为初始治疗效果的早期预测因子，2项指标水平的同时升高或降低与无进展生存期的长短一致[2]。由此可见，CEA和CA19-9等传统血清学标志物，不仅可以作为肿瘤筛查的标志物之一，且可用于综合判断疾病的进展。

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）

CTCs是1869由Ashworth[3]首次提出的概念，指源于原发肿瘤或转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力，并通过入侵组织基质而进入血管的肿瘤细胞。CTCs的发现可能有助于实现对癌症的无创早期诊断，且通过动态观察CTCs有利于了解患者的病情变化，以及监测其发展演变的过程，进而帮助临床及时、合理地调整治疗方案。CTCs的遗传及表型特征往往与原发性肿瘤不同，也可作为选择最有效的靶向治疗的依据。此外，由于CTCs的检测与疾病分期、复发率、生存率有关，因此已受到了广泛关注[4]。

目前，诸多研究报道了血循环中检出CTCs与肿瘤预后因素（如肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、分期、淋巴和静脉浸润）之间有密切关系。基于此，部分研究通过检测CTCs相关标志物来进一步判断疾病的预后。如有研究纳入了98例Ⅰ期至Ⅳ期的胃癌患者，基于生存素（Survivin）的肿瘤特异性，取血清样本进行qRT-PCR分析，从而间接判断CTCs的表达水平，结果发现生存素mRNA阳性和阴性的患者3年无病生存期发生率分别为53.1%和84.3%，表明生存素mRNA水平是一个独立的预后因子[5]。Yie等[6]的研究显示，通过检测CTCs中生存素的表达情况来预测肿瘤复发的特异度、灵敏度和准确率分别为100%、100%和84.6%。Bertazza等[7]对70例Ⅰ期至Ⅳ期胃癌患者进行研究，将生存素与其他血液标志物（如CEA、血管内皮生长因子）作比较，结果显示，单因素和多因素分析只确定了生存素mRNA表达可作为一个独立的预后因素。另一项针对94例胃癌患者的研究显示，通过检测B7-H4 mRNA的表达量来评估是否存在CTCs，与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、淋巴浸润及静脉浸润有关[8]。也有研究采用比色膜阵列法，对结肠直肠癌患者外周血CTCs中的多个mRNA标志物进行检测，方法包括合成已鉴定的结肠直肠癌相关寡核苷酸（CK-19、CK-20、CEA、重组人胰腺再生蛋白 4、T细胞淋巴瘤侵袭转移诱导因子1 mRNA），并在尼龙膜上标记，构建结肠直肠癌的诊断基因芯片。其采用反转录PCR法，提取结肠直肠癌患者的外周血，并扩增出标记的cDNA，并与基因芯片杂交，通过显色检测杂化信号，用于进一步的临床评价。结果发现，这种基于膜阵列的检测血CTCs方法的诊断灵敏度、特异度和准确率远高于单一标志物，可用于结肠直肠癌早期诊断和术后监测[9]。另外，Yamamoto等[10]开发的一种新的体外培养CTCs方法，使CTCs在体外培养和体内异种移植模型中的功能研究成为可能，而随着分离和富集肿瘤细胞技术的发展，可能有助直接判断疾病的进展和开发个性化治疗，以有效抑制晚期肿瘤患者的疾病进展。

基于上述结果推测，CTCs的潜在标志物可能在不久的将来陆续被发现，从而有可能鉴别早期肿瘤患者，准确预测患者的肿瘤进展和预后。随着富集CTCs技术的提高，未来可能建立更为灵敏的检测平台，以动态了解患者的肿瘤生物学特征和血液内环境的改变，从而为临床提供更为有效的个体化治疗依据。

微小 RNA（microRNA，miRNA，miR）

miRNA是一类长度约为22 nt的内源性非编码RNA，其通过与靶基因转录互补结合来调控基因的表达。miRNA非常稳定，从不同的生物材料(包括组织、血液、粪便、唾液、腹水，甚至石蜡包埋块)中都可以很容易地提取到miRNA，这使其成为生物标志物研究领域中具有吸引力的分子群。期待未来其能在疾病的诊断和预后判断以及靶向治疗的研究方面发挥作用。

一、诊断

近年来研究发现，胃癌患者的血清miR-21、miR-222表达水平明显高于健康对照患者，而miR-21诊断胃癌的灵敏度和特异度分别为86.7%和72.2%，miR-222诊断胃癌的灵敏度和特异度分别为62.5%和56.2%。故认为miR-21和miR-222可以作为一种潜在的无创检测胃癌的工具[11]。

二、预后

1．胃癌：miR-135a在早期胃癌患者中的表达下调。胃癌细胞系功能分析显示，miR-135a能抑制细胞活力、上皮-间质转化、细胞侵袭和迁移，其水平降低是胃癌淋巴结转移的独立危险因素之一[12]。

2.结肠直肠癌：在结肠直肠癌研究方面，与Ⅰ期至Ⅲ期患者相比，Ⅳ期患者的血清miR-200c水平升高。同时有研究发现，miR-200c水平与结肠直肠癌患者的生存期之间存在关联。一项纳入了109例结肠直肠癌患者的研究显示，与健康对照组相比，结肠直肠癌患者肿瘤组织中的miR-200c表达水平均升高。此外，研究还发现预后良好的患者其血清miR-200c水平在手术切除及化疗后可恢复到正常水平；有复发或远处转移患者的血清miR-200c水平则在治疗后短暂下降后可能再次升高。可见，miR-200c可作为肿瘤复发和淋巴结转移的预测因子以及预测结肠直肠癌预后的独立指标[13]。

另一个具有显著预测肿瘤患者预后潜力的miRNA是miR-21。对105例结肠直肠癌患者的研究表明，患者血中的miR-21表达水平明显升高，且miR-21表达水平升高与肿瘤淋巴结转移及远处转移、肿瘤大小、生存不良有关[14]。此外，研究还发现血清miR-21其可作为结肠直肠癌预后的独立生物标志物。有研究检测了306例结肠直肠患者组织中的miR-21表达水平,经临床病理因素比较，miR-21高表达患者的总体生存率及无病生存率均明显低于miR-21低表达患者[15]。此外，有研究报道了miR-378、miR-126、miR-224、miR-429、miR-182、miR-32、miR-214、miR-182、miR-92a、miR-124 等 miRNA 的表达水平与患者的预后相关，机制涉及mi-RNA的失调与上皮间质转化诱导转录因子的调控相关，这些变化增强了肿瘤的发生和转移[16]。

环状RNA

环状RNA是1976年通过电子显微镜在RNA病毒中首次发现的，是一类以单链共价闭环结构为特征的新型长链非编码RNA，其特征是单链共价闭环结构，没有5′端帽或3′多聚尾。环状RNA具有保守性、丰度高、半减期长等特点，环状RNA可作为微小RNA海绵、基因转录和表达的调控因子、RNA结合蛋白等方式调控基因和蛋白的表达,部分证据揭示了环状RNA与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移密切相关。相信通过不断深入研究，环状RNA将会成为一种成熟、可靠的诊断和预后判断的新型标志物[17]。

一、胃癌的诊断和预后评估

Li等[18]首次通过PCR的方法证实，101例患者的胃癌组织和血浆中circ_002059表达下调，并与肿瘤的远处转移及疾病分期密切相关，可作为诊断胃癌的潜在标志物之一。此外，有研究表明，circ_0000745在胃癌中的表达明显下调，且与肿瘤分化及肿瘤淋巴结转移有关；circ_00000181在胃癌患者中表达也下调，且与肿瘤的分期、分化等多种临床病理因素有关[15]。Sun等[19]的研究发现，circ_0000520的表达水平在胃癌组织、血浆和胃癌细胞系中均下调，其诊断胃癌的受试者工作特征曲线下面积在血浆中为0.896 7，提示其可以作为一种新的生物诊断标志物。另有研究涉及了circ_0006633、circ_0003159、circ_0000190、circ_0001649、circ_0066779，其表达下调与患者肿瘤远端转移及肿瘤分期呈负相关，表明这些环状RNA作为生物标志物在胃癌筛查及患者预后评估方面具有潜在的作用，但还需要更多研究来证实其临床价值[20]。

二、结肠直肠癌的分期和预后

目前，大量与结肠直肠癌相关的环状RNA已被发现[21]，如circ_001988的下调与周围神经浸润和分化密切相关，circ_103809表达水平与淋巴结转移及肿瘤分期呈显著负相关，而circ_104700表达水平与肿瘤远处转移呈显著负相关。在结肠直肠癌组织中也可见一些上调的环状RNA，如circ_0000069在结直肠癌组织中有明显的过表达，与肿瘤分期呈正相关，具有促进结肠直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用，而其功能丧失分析则表明，沉默circ_0000069具有相反的作用，在体外培养的结肠直肠癌细胞中能显著诱导G0/G1期的细胞阻滞。此外还发现，circ_001569的表达在结肠直肠癌组织中明显上调，其可竞争性地结合并抑制miR-145活性，导致miR-145靶基因表达增加，促进结肠直肠癌细胞的增殖和侵袭性。同样，ciRS-7在结肠直肠癌组织中表达上调，被证明是肿瘤抑制因子miR-7的竞争性内源性RNA，而过度的ciRS-7可以破坏正常的miR-7功能，通过竞争miR-7所诱导的相关信号通路的激活，促进结肠直肠癌细胞的侵袭[22]。随着研究对环状RNA与消化道肿瘤之间关系的理解的不断深入，这些环状RNA可能作为潜在生物标志物，更多的诊断和治疗方案将被开发出来用于消化道肿瘤的预防和治疗。

循环肿瘤 DNA（circulation tumor DNA，ctDNA）

ctDNA是肿瘤细胞通过坏死、凋亡、分泌向血液中释放的游离 DNA，其保留了肿瘤特异性基因特征和表观遗传学特征，如癌基因和抑癌基因的点突变、拷贝数变异、DNA甲基化和染色体重排，这一特点促使 ctDNA成为潜在的生物标志物。

最近有学者综述了35项围绕ctDNA作为诊断工具、预后标志物和（或）衡量胃肠道肿瘤异质性的研究，结果发现释放入血的ctDNA携带各类突变和融合基因，而这些成为了识别癌症的密码，在绝大数肿瘤中，通过ctDNA能够识别相关的标志性改变，如RAS、HER2等基因的改变[23]。也有多项以ctDNA为基础的研究对肿瘤转移和患者生存情况进行了预测。其中，Fang等[24]对 277例胃癌患者的8个基因进行ctDNA的突变研究，最后证实ctDNA在Ⅳ型胃癌患者的血样本中明显升高，且ctDNA水平高的患者发生腹膜复发的可能性更大，5年总生存率显著降低。在晚期（Ⅲ期或Ⅳ期）胃癌中，携带ctDNA突变的患者更易发生血管侵犯，5年总体生存率低于未携带cpDNA突变的患者（5．6%比 31．5%）。由此推测，ctDNA 基线水平的升高和（或）ctDNA中检测到的突变数量的增加，与患者的生存不良及肿瘤多处转移有关。也有相关研究报道，与左侧结肠癌、直肠癌相比，右侧结肠癌患者的ctDNA突变数量更高[25]。另外，Kim 等[26]的研究显示34名健康对照者和30例早期胃癌患者、晚期胃癌患者的ctDNA平均水平分别为（79．78±8．12）ng/mL、（106．88±12．40） ng/mL、（120．23±10．08） ng/mL。肿瘤大小、根治性切除等代表肿瘤负荷的变量也与ctDNA水平有关，术后24 h的ctDNA水平较术前明显下降 [（112．17±13．42） ng/mL 比 （77．93±5．94） ng/mL）]，提示 ctDNA 水平的变化可作为早期检测肿瘤、预测肿瘤负荷、预测治疗切除甚至预后的可靠生物标志物。此外，还有研究提出了利用ctDNA评估治疗反应和残留转移性疾病的可行性，如Kehagias等[27]通过多临床中心试验（临床实验NCT01929616）调查了141例晚期结肠直肠患者，在开始瑞格菲尼治疗后的基线和第14天检测了血清ctDNA水平，发现14 d后ctDNA量≥1 μg/mL患者的无疾病进展期和生存期明显低于ctDNA量＜1 μg/mL的患者。Murray等[28]对 172例术后 CRC患者进行了前瞻性研究，术后ctDNA呈阳性的患者复发的风险增加，证明ctDNA是残余疾病和复发的标志物（临床试验12611000318987）。

这些研究均表明，tDNA的检测作为一种液体活检技术，具有操作简便、侵害性小、易于动态监测等优势。随着研究的深入，未来其可能广泛应用于肿瘤筛查或早期诊断、术后检测残余病灶及预测复发、指导靶向用药、动态监测治疗效果、判断预后等中。

细胞因子

由于激活促炎细胞因子在胃癌、结肠直肠癌等恶性肿瘤疾病中可诱导癌细胞死亡，从而发挥重要作用。因此，对促炎细胞因子的精确调控和潜在诊断标志物的探索，有助于在将来诊断、预防和治疗胃肠道肿瘤。

一、白细胞介素（interleukin，IL）

近期有研究对IL-6作为诊断、预后或预测肿瘤生物标志物或潜在治疗靶点的临床应用进行了评估，发现循环血IL-6水平升高与胃癌患者的总生存期短有关，还发现胃癌患者的血IL-6水平明显高于健康对照者，而当患者并存肝转移时，其血IL-6水平则显著升高，提示IL-6水平与肿瘤转移有关。同时该研究还发现，IL-6水平升高与肿瘤大小、淋巴结转移程度及分期间也存在着显著相关性[29]。将结肠直肠癌患者作为研究对象进行评估发现，其IL-6水平在肿瘤发生远处转移和播散性转移的患者中显著升高，76例结肠直肠癌患者的IL-6水平明显高于38例结肠直肠腺瘤患者及35名健康对照者，IL-6水平诊断结肠直肠癌的价值 （曲线下面积为0．90）较 CEA（曲线下面积为 0．79）、C 反应蛋白 （曲线下面积为 0．82）及 CA19-9（曲线下面积为 0．65）更高[30]。但抑制IL-6表达的是否能缓解胃肠道癌症患者的症状和提高其生活质量，目前还不清楚，有待进一步研究。此外，促炎细胞因子IL-32调节细胞生长、代谢和免疫调节，参与炎症疾病，在血液恶性肿瘤和实体肿瘤的病理生理过程中发挥着重要作用，且一些IL-32亚型与疾病结局有关，并被证明对各种不同的恶性肿瘤如胃癌等的进展具有积极的影响[31]。

二、半胱氨酸蛋白酶抑制剂

另有研究涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂 SN（Cystatin SN），其属于2型胱氨酸蛋白酶体超家族成员的一类细胞因子，在哺乳动物中广泛表达和分布，其可能参与了炎症、细胞周期、细胞衰老、肿瘤发生和转移。近期研究发现，Cystatin SN可能是一种潜在的肿瘤预后标志物和肿瘤治疗靶点，其在胃癌组织中表达上调，与肿瘤分期呈显著相关，与患者生存的概率密切相关。单变量分析表明，其可能是胃癌患者的一个独立预后因素。此外，Cystatin SN还在结肠直肠癌组织中高表达，参与了肿瘤生长和转移，可能是结肠直肠癌的独立预后因子，而相关机制可能影响着IL-6信号通路，通过调节自噬和氧自由基的产生来抑制细胞死亡[32]。由此可见，促炎细胞因子在肿瘤预测中的价值同样值得关注，并需要进一步探索。

总 结

早期发现和准确监测癌症对改善临床结果非常重要。内镜活检和（或）手术切除标本是诊断胃癌和结肠直肠癌的金标准，也是基于基因组、免疫参数分析选择治疗策略的有用手段。然而，由于这些方法具有侵袭性，且这些标本在治疗过程中，特别是化疗过程中，并不总是反映肿瘤动力学和药物敏感性，因此很难实施。因此，进一步研究近期发现的一些血清新型生物标志物，可能有望达到实时监测肿瘤动态，用于达到早期诊断、预后评估、预测复发和治疗效果的目的。