加米霉素注射液内毒素检查方法研究

李朋朋　侯林

摘要：参照《中华人民共和国兽药典》2015版（后简称兽药典）一部附录200页细菌内毒素检查法的有关规定，对加米霉素注射液内毒素限度及检查方法进行了研究。结果显示，加米霉素注射液在0.075～0.3mg/mL时对鲎试剂无增强或抑制作用，产品内毒素含量均小于限定值125EU/mL，符合规定。通过试验研究，建立了加米霉素注射液的内毒素检查方法，且采用凝胶法对其进行细菌内毒素检查是可行的。

关键词：加米霉素注射液；内毒素检查；干扰试验

细菌内毒素检查法又称鲎试验法，它与传统家兔热原检查法相比，具有简便、快速、灵敏、准确、重现性好等优点，在兽用注射液质量控制中的应用越来越广泛。加米霉素注射液属于动物专用的半合成大环内酯类抗生素，法国梅里亚公司的Zactran已被我国批准进口注册。笔者参照《中华人民共和国兽药典》2015版（下称兽药典）一部附录200页细菌内毒素检查法，对加米霉素注射液进行了细菌内毒素检查方法的研究，为该产品细菌内毒素的检查提供依据。

1试验材料

1.1鲎试剂

鲎试剂，灵敏度（λ）为0.25EU/mL，0.1mL/支，批号161118，厦门市鲎试剂实验厂有限公司；鲎试剂，灵敏度为0.25EU/mL，0.5mL/支，批号1605270，湛江安度斯生物有限公司。

1.2细菌内毒素工作标准品

细菌内毒素工作标准品，80EU/支，批号201784，中国药品生物制品检定院。

1.3细菌内毒素检查用水

检查用水，5mL/支，批号161004，厦门市鲎试剂实验厂有限公司。

1.4仪器与耗材

除热原枪头：200μL、1000μL；除热原铝盖玻璃试管：10×75mm、13×100mm，无热原空安瓿：2mL，以上耗材均购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司。MS3B$25涡旋混匀器，IKA。可调微量移液器：量程为10～100、20～200和100～1000μL，Eppendorf Research型，

德国Eppendorf公司。试管恒温仪，TAL-40D型，湛江安度斯生物有限公司。

1.5试验药品

加米霉素注射液，含量：150mg/mL，规格10mL/支，批号为20141101、20141102、20141103、20171201、20171202、20171203，由洛阳惠中兽药有限公司提供。

2方法与结果

2.1鲎试剂灵敏度复核试验

以细菌内毒素检查用水溶解内毒素工作标准品，并配制成含内毒素为2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ系列浓度的溶液，依法进行加样操作。每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照，记录结果，并按式λc=antilg（∑^X/4）计算λ_c值，结果见表1。由表1数据可知三种鲎试剂的复核灵敏度λ均在0.5～2λ之间，表明这三种鲎试剂灵敏度均符合规定。

2.2细菌内毒素限值确定

根据公式L=K/M计算加米霉素注射液细菌内毒素限值，其中L为细菌内毒素限值，注射剂的K值为5EU/（kg·h），M为每千克体重每小时的最大供试品剂量。加米霉素注射液临床推荐剂量为6mg/（kg·bw），由此可知本品每小时最大使用剂量亦为6mg/（kg·bw），所以其M为6mg/（kg·bw），按照注射液含量折算为M=0.04mL/kg，进而求得加米霉素注射液内毒素限值为125EU/mL。

2.3干扰预试验

根据文献参考设计干扰试验预试验。由于现有鲎试剂的灵敏度在0.06～0.5EU/mL之间，因此样品的最大有效稀释倍数MVD=L/λ=250～2000倍，采用不超过最大有效稀释倍数的溶液进行干扰预试验。取加米霉素注射液（批号为20141101），无菌操作，用细菌内毒素检查用水稀释成4.8、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15、0.075mg/mL系列浓度，依法操作试验。结果见表2。预试验结果显示，加米霉素注射液在0.075～0.3mg/mL时，NPC（供试品）系列溶液对鲎试剂反应均为阴性，PPC（供试品阳性）系列溶液均为阳性，表明加米霉素注射液配制成≤0.3mg/mL的稀释液时对鲎试验反应无干扰作用。

2.4正式干扰试验

根据预试验确定正式干扰试验中样品的浓度为0.3mg/mL。取供试品3批，无菌操作，用细菌内毒素检查用水将供试品稀释成0.3mg/mL（即500倍稀释），依法检查，结果见表3。结果显示当供试品配制为0.3mg/mL浓度时，Es在0.5～2.0λ范围内，Et均在0.5～2.0Es范围内，表明20141101、20141102、20141103三批供试品配制为0.3mg/mL浓度时，用2个厂家生产的鲎试剂试验均无干扰作用。

2.5样品细菌内毒素检查

取供试品，依法考察了6批加米霉素注射液的内毒素限值，结果见表4。由结果可知6批供试品中，每1 mL的加米霉素注射液含内毒素的量均小于125EU。

3讨论

在进行上述试验过程中，阳性对照管不发生凝集的现象时有发生，后经查找原因，最终确定是因为孵育温度不够及操作温度過高造成的。通过严格控制孵育温度，并在必要时改为冰浴操作，阳性对照不成立现象明显改善。另外，虽然鲎试剂不能剧烈震荡，但当内毒素工作标准溶液与复溶后的鲎试剂混合时，应轻缓震动混匀，否则也易造成阳性管不凝集现象。因此鲎试验时要严格控制孵育温度、孵育时间及操作速度，并确保鲎试剂与内毒素工作标准品溶液混合均匀。

本试验用两个厂家的鲎试剂对加米霉素注射液3个批号进行了干扰试验。结果表明加米霉素注射液在0.3mg/mL稀释液浓度下没有干扰作用，可进行细菌内毒素检查。另外，根据试验结果，确定加米霉素注射液的细菌内毒素检查方法为：取待测样品，用细菌内毒素检查用水稀释至每1mL含0.3mg的溶液，依法检查，每1mL加米霉素注射液含内毒素的量应小于125EU。

从表4结果可知供试品细菌内毒素含量均符合规定，因此该注射液在当前制定的内毒素限值下，采用凝胶法进行细菌内毒素检查是可行的。