赵秀玲,党亚丽*
(1.黄山学院生命与环境科学学院,安徽 黄山 245021;2.宁波大学海洋学院,浙江 宁波 315211)
莲子心(Nelumbinis Plumula)为睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)种子的绿色幼叶及胚根,为国家卫生部批准的药食两用的植物,并在现版《中国药典》中有记载[1-2]。杨小青等[3]对莲子心总生物碱做了安全性评价实验,结果表明大鼠对莲子心总生物碱对最大耐受剂量为5 000 mg/(kg·d)。莲子心是抗菌广谱、高效、无毒副作用的天然资源,具有清心安神、止咳化痰、止血抗炎等功效,在降压、抗心律失常等方面作用显著。莲子心有效成分的化学结构和药理作用仍是目前关注的热点,现将莲子心的化学成分组成、提取和药理作用进行综述,为进一步开发莲子心提供参考。
莲子心中的主要成分为不同种类的异喹啉生物碱。从莲子心里提取分离得到的生物碱包括甲基莲心碱[4]、莲心碱[5]、异莲心碱[4,6]、莲心季铵碱[7]、荷叶碱[7-8]、前荷叶碱[9-10]、S-N-甲基异乌药碱[11],具体结构式见图1。李萍等[12]从莲子心脂溶性部位分离得到12 种单体化合物,其中4’-甲氧基-N-甲基衡州乌药碱、莲明碱、N-甲氧基头花千金藤二酮B和N-甲基紫堇定为该植物中首次发现的化合物,且4’-甲氧基-N-甲基衡州乌药碱和亚美罂粟碱为同分异构体。
图1 莲子心中的生物碱类化合物的结构式[13-14]Fig.1 Alkaloids in Nelumbinis Plumula[13-14]
林志钦等[15]利用酶法提取莲子心中黄酮类化合物,测得总黄酮得率4.50%。从莲子心分离的黄酮类化合物包括异夏佛托苷、槲皮素-3-O-新橙皮糖苷、夏佛托苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、异牡荆苷、香叶木素-7-O-芸香糖苷、牡荆苷、荭草苷、异荭草苷、芹菜素-6-C-8-C-二葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-鼠李糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-木糖苷、芹菜素-6-C-鼠李糖-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-木糖-8-C-葡萄糖苷、异鼠李糖-3-O-芸香糖苷、异槲皮苷、山柰酚-3-O-刺槐双糖苷、5,7-二羟基-4’-甲氧基黄酮-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基]-β-D-吡喃葡萄糖苷、忍冬苷、槲皮素-3-O-葡萄醛酸苷、木犀草素-6-C-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-8-C-β-D-葡萄糖苷、金圣草素-7-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷[14,16-20]。沈元帅[21]从莲子心制备得到4 种黄酮碳苷:芹菜素-6-C-α-L-呋喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、3’-羟基芹菜素-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、3’-羟基芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-丙烯酸丁酯-5,7,3’,4’-四羟基黄酮;这几种物质是在睡莲科中首次被报道。邵建[22]从莲子心的乙醇提取物中分离纯化出木犀草素-4’-O-β-D-(4-O-β-D-葡萄糖)-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷,这些物质首次从该属植物中分离得到。莲子心黄酮化合物骨架结构式见图2,其取代基及连接位置见表1。
表1 从莲子心中分离到的黄酮类化合物的结构[20]Table1 Structures of flavonoids isolated from Nelumbinis Plumula[20]
莲子心中含有丰富的植物甾醇和甾醇酯,被誉为“生命的钥匙”[23-24]。Bi Yanlan等[25]从莲子心毛油不皂化物中分离出β-谷甾醇、△5-燕麦甾醇、菜油甾醇和豆甾醇。莲子心的毛油质量分数为13.63%~14.04%,毛油中的总甾醇含量为10.93~12.76 g/100 g,β-谷甾醇、△5-燕麦甾烯醇和菜油甾醇是甾醇酯中的主要甾醇,亚油酸、油酸和山嵛酸是甾醇酯中的主要脂肪酸[26]。莲子心甾醇及其酯的部分结构式见图3。
图3 莲子心中的甾醇及其酯类化合物[27-28]Fig.3 Steroids and esters in Nelumbinis Plumula[27-28]
莲子心中还含有挥发性成分,主要成分为Z-9,17-十八碳二烯醛、8,11-十八碳二烯酸甲酯、14-甲基-十五烷酸甲酯[29]、芳姜黄酮、β-芳姜黄酮、α-芳姜黄酮[30],棕榈酸甲酯、顺式-9-十六碳烯酸、生育酚、5-羟甲基-2-呋喃甲醛[27]、14-甲基正十五酸、十七烷酸、植物醇、9,12-十八碳二烯酸、3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯-1-醇、γ-谷甾醇、γ-生育酚[31]等。
吴春美[32]从‘建宁’莲子心中提取多糖的得率达10.32 mg/g,并分离得到莲子芯多糖(embryo of the seeds of Nelumbo nucifera Gaertn. polysaccharides,ESP)-I、ESP-II和ESP-III 3 个组分,其相对分子质量分别为2.01×104、7.94×103、2.80×105;ESP-I的单糖组成为D-木糖、D-半乳糖、甘露糖,对应质量比为1.00∶7.18∶0.51;ESP-II的单糖组成为D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、甘露糖,对应质量比为1.00∶15.05∶8.10∶3.05。俞远志[33]研究发现莲子心粗多糖(embryo loti polysaccharides,ELPS)组分为ELPS-Ⅰ~ELPS-VII,结果证明ELPS-VII是均一性多糖,该组分由L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖和D-半乳糖组成,不含蛋白质、多肽和核酸,结构中同时存在α型和β型吡喃糖基,且组分中可能含有(1→6)-型糖苷键。Liao等[34]的研究结果表明莲子心中含有木糖、葡萄糖、果糖、半乳糖和海藻糖等水溶性多糖。
中草药所含成分十分复杂,既有有效成分,又有无效成分和有毒成分。为了提高中草药的治疗效果,就要最大限度地提取有效成分,同时去除无效成分及有毒成分。从莲子心提取生物碱的研究具有重要经济价值和良好应用前景,至今总生物碱的提取工艺仍受到人们的广泛关注。
超声辅助提取主要是利用超声的机械效应、空化效应、热效应及很多次级效应(如击碎、乳化、扩散等),这些效应有助于植物中有效成分的转移。罗平等[35]利用超声辅助提取技术制备莲子心中总生物碱,在料液比1∶40.4(m/V)、乙醇体积分数64.4%、超声提取时间40 min条件下,提取率为128.673 mg/g。表面活性剂能显著降低溶液的表面张力,增强溶剂对物料的润湿和渗透作用,对天然产物的有效成分具有增溶作用。利用表面活性剂降低表面张力,可达到增强超声提取的效果。孙俊杰[36]利用表面活性剂协同超声波法提取莲子心总生物碱,在2 mg/100 mL辛癸基葡萄糖苷、料液比1∶50(m/V)、乙醇体积分数70%、超声功率105 W、超声时间25 min的条件下,提取前浸泡20 min,超声提取1 次的提取率为140.624 mg/g。表面活性剂协同超声波法提取莲子心总生物碱相关报道还较少,较单纯超声法提取率有所提高[35-36],并且省时绿色节能。超高压提取是利用100 MPa以上的流体静压力作用于溶剂和中药的混合液达到提取的目的[37];浊点萃取是以表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础,通过改变一定的萃取条件达到分离的目的[37]。朱荣华等[37]利用超高压辅助浊点萃取法提取莲子心总生物碱,以质量分数5%的烷基酚聚氧乙烯醚为溶剂,在提取压力100 MPa、提取时间1 min、料液比1∶20(m/V)条件下,得率为103.6 mg/g。超高压辅助浊点萃取法是在密闭环境条件下常温进行的,具有提取时间短、绿色环保的优点,是一种提取和富集莲子心中生物碱的新方法。半仿生提取法从生物药剂学角度模拟口服给药,是根据药物经胃肠道给药特点设计的一种新的提取工艺,符合口服药物经胃肠道转运吸收的原理。袁小红等[38]利用半仿生提取法提取莲子心总生物碱,第一煎水、第二煎水、第三煎水的pH值分别为5.0、6.0、8.0,再用8 倍体积的水回流提取3 次、总提取时间4 h的条件下提取率为31.396 mg/g。袁小红[39]在利用半仿生提取醇沉法提取莲子心总生物碱的基础上,将提取液浓缩后,加入计算量乙醇沉淀去除杂质,除去杂质后乙醇的体积分数达60%,静置24 h进行提取,提取率为852.998 μg/g。可见半仿生提取法中提取液经过乙醇沉淀后,有效成分会降低,这可能跟杂质在沉淀过程中包裹或吸附了部分有效成分有关。
黄酮类化合物的提取方法需根据其结构和相关性质(如水溶性、极性等)进行选择。黄中梅等[40]研究了莲子心总黄酮的超声波萃取工艺,结果表明在乙醇体积分数60%、提取温度70 ℃、料液比1∶24(m/V)、超声波萃取时间30 min的条件下,总黄酮的提取率为10.86 mg/g。超声波萃取法节省溶剂、能耗低、效率高,是中草药有效成分提取较成熟的方法之一。微波辅助提取是在传统萃取工艺基础上强化传热、传质的物理过程。余其凤等[41]对莲子心总黄酮的微波辅助提取研究结果表明,当乙醇体积分数为65%、固液比为1∶25(m/V)、微波辅射功率为400 W、微波辐射时间为30 s、微波提取3 次时,莲子心总黄酮提取率达1.021%。酶辅助提取法是利用生物酶、含酶的细胞器或细胞作为生物催化剂来实现化学反应的。林志钦[42]研究了酶法辅助提取莲子心总黄酮的工艺,体积分数50%乙醇溶液作溶剂、液料比19∶1(m/V)、纤维素酶添加量0.3 g/100 mL、pH 5.5,在60 ℃下酶解2 h,莲子心总黄酮提取率可达4.50%。酶法辅助提取莲子心总黄酮较之微波法提取率有明显提高[41-42],反应条件温和,减少了提取工艺成本,且萃取出的莲子心总黄酮色泽金黄、透明澄清,是适合提取莲子心中黄酮类化合物的方法。
超临界流体萃取技术的原理是将超临界流体控制在超过临界温度和临界压力的条件下,从目标物种萃取有效成分,当恢复到常温和常压时,溶解在超临界流体中的成分即与超临界流体分开。张敏等[43]应用超临界CO2技术萃取莲子心油,确定超临界萃取的最佳工艺条件为:原料水分质量分数5%、CO2流速30 L/h、粉碎度60 目、萃取时间2 h、萃取温度50 ℃、萃取压力32 MPa、分离温度45 ℃、分离压力9 MPa,此时莲子心油的出油率为14.09%。贾冬冬[44]采用超临界CO2提取莲子心中的挥发油,最佳条件为萃取温度和压力55 ℃和35 MPa,萃取时间150 min,原料粒度60~80 目,CO2流速2 L/min,在此条件下挥发油的提取率为12.24%,β-谷甾醇的提取率为0.903%。超临界CO2提取技术具有萃取率高、无溶剂残留、选择型好、无污染的优点,只需控制压力和温度即可达到提取混合物中不同组分的目的,在一定程度上克服了中药生产中的一些瓶颈问题。陈丽佳等[45]研究得出提取莲子心中甾醇的最佳工艺条件为:料液比1∶12(m/V)、提取时间12 min、温度44 ℃、提取3 次,此条件下总甾醇得率为(1.67±0.11)%。超微粉碎技术的原理是利用粉碎设备进行挤压、冲击、摩擦、碰撞和剪切等,得到粒径为1 nm~100 μm的微小固相颗粒,有利于其中营养成分的释放和吸收。莲子心经超微粉碎后利用乙醇法提取其中的总酚,得出超微粉碎总酚含量为1 366.33×10-2mg/g,机械粉碎莲子心提取液多酚含量为1 036.34×10-2mg/g,莲子心中总酚的提取率提高了24.09%[46]。超微粉碎后中位粒径降低,粒径范围相对集中,分布较均匀,比表面积增加,较之机械粉碎显示更高的多酚溶出率[46]。
目前关于莲子心药理作用的研究,主要集中在生物碱(包括莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、荷叶碱和前荷叶碱等)和黄酮类物质(包括木犀草苷、金丝桃苷、芸香苷等),以及莲子心多糖等成分的功能[26]。莲心碱有较好的抗心律失常作用;甲基莲心碱能抑制窦房结细胞的自律性及延缓房室传导;莲心季铵碱可剂量依赖性地增加离体心肌的收缩力,且作用强于氨力农和罂粟碱;异莲心碱静注可剂量依赖地轻度降低麻醉大鼠心率、收缩动脉压、平均动脉压、舒张动脉压、左室收缩压、左室压力变化速率,而对左室舒张末压力无显著影响[47]。对于莲子心药理作用的研究已经比较深入和全面,如沈元帅[21]综述过莲子心的降压、抗心律失常、降血糖、免疫抑制及促进脂肪分解、抵制肺成纤维细胞增殖和抑菌等作用或功效;谢纲等[48]综述过莲子心的协同抗肿瘤、正性肌力、抑制增生性斑痕、皮保护等作用或功效。
Liao等[49]研究莲胚芽多糖对I型糖尿病小鼠的保护作用,结果表明莲胚芽多糖能显著降低非肥胖型糖尿病小鼠的脾脏绝对质量,并且这种药效呈量效依赖关系;能显著降低亲/抗炎细胞因子(肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-10、IL-6)基因在非肥胖型糖尿病小鼠肝脏中的相对表达;能降低脾细胞分泌的IL-6/IL-10比率和抑制促炎性TNF-α和IL-6细胞因子的产生。莲心碱中的甲基莲心碱可抑制多种诱聚剂诱导的高脂血症患者和健康成人血小板聚集,对高脂血症患者并发血栓性疾病有一定的防治作用[50]。
莲子心中的抗氧化成分可能是生物碱类化合物如莲心碱、甲基莲心碱、异莲心碱等,黄酮类化合物莲子心多糖和莲子心糖蛋白等[20]。生物碱可作为活性氧猝灭剂,通过与O2碰撞,本身获得能量而使1O2失活转变为3O2。莲子心中主要活性成分是异喹啉类生物碱,其中以莲心季铵碱、甲基莲心碱、异莲心碱和莲心碱为代表,这4 种生物碱对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞株ECV304氧化损伤有一定的保护作用,4 种生物碱的浓度分别为100.0、0.1、0.1、0.1 μmol/L时,细胞活性分别为H2O2损伤组的118.2%、112.8%、125.6%和129.3%(P<0.01或0.05);这4 种莲子心生物碱均可增加损伤内皮细胞的一氧化氮合酶活性(P<0.05),莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱均可提高H2O2致损内皮细胞的NO浓度,作用机制可能是通过提高一氧化氮合酶活性促进血管内皮细胞释放NO,从而发挥保护内皮的功能[51]。
杨小青等[52]研究不同提取方法所得莲子心总生物碱的抗氧化活性,发现不同提取方法对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐羟自由基清除活性的影响顺序为:回流提取>超声提取>浸渍提取,不同提取方法对超氧阴离子自由基活性的影响顺序为:超声提取法>回流提取>浸渍提取;可见回流法提取的生物碱具有最强抗氧化活性。张俊生等[53]研究了莲子心总黄酮提取物对羟自由基的清除效果及抗油脂氧化作用,结果表明,莲子心总黄酮提取物质量浓度(7.26~21.68 μg/mL范围内)与羟自由基清除能力成正比,且该提取物对油脂的抗氧化能力强于柠檬酸和VC。俞远志[33]采用β-胡萝卜素漂白模型测定莲子心粗多糖和莲子心糖蛋白的抗氧化活性,结果表明莲子心粗多糖对β-胡萝卜素-亚油酸脂质过氧化体系有良好的抑制作用,并且在同等剂量下要优于VC;在2~50 mg/mL剂量范围内,其作用效果与药物剂量呈正相关关系。莲子心糖蛋白虽然也对脂质抗氧化具有抑制作用,但其效果不及莲子心粗多糖[33]。
肝纤维化是大多数慢性肝病的共同病理特征,其特征是组织内细胞外基质成分大量增生和异常沉积[54],最后导致威胁生命的情况发生,比如肝硬化、原发性肝癌,甚至肝衰竭等。刘志勇等[55]研究莲子心萃取物抑制大鼠肝纤维化的作用机制时发现,80 μg/mL的莲子心萃取物可抑制细胞内核转录因子抑制蛋白(inhibitor kappa B protein,IκB)α的磷酸化、甲型平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达、TNF-α所引发的肝星状细胞内过氧化氢酶的含量降低以及核转录因子(nuclear factor,NF)-κB的活化;还可下调α-SMA及犬I型胶原蛋白α2(collagen α2,collα2)mRNA的表达,降低肝纤维化、大鼠丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸转移酶(aspartate aminotransferase,AST)的含量及肝胶原蛋白的含量。
糖尿病肾病主要是由于糖尿病代谢异常引发了肾小球硬化,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶被激活,产生大量活性氧自由基(活性氧自由基性质十分活泼,可以氧化多种生物大分子,在正常情况下肾脏只产生少量活性氧自由基,可被耐受而不损害肾功能),对细胞外的基质重构和肾小球内血流动力学均有不同程度的影响。此外,活性氧自由基还有可能通过调节信号转导,影响糖尿肾病的发生和发展[56]。邓碧[57]发现各剂量莲子心提取物能减少NADPH氧化酶亚基p22phox和氧化酶p67phox的表达,结果表明莲子心提取物主要成分甲基莲心碱、异莲心碱是通过减弱肾脏NADPH氧化酶活性,减弱肾脏的氧化应激,发挥肾脏保护作用。Wang Mingxing等[58]研究发现荷叶碱具有降低血清尿酸水平、改善肾功能,以及抑制系统和肾IL-1β的分泌和氧嗪酸钾诱发高尿酸血症的作用;荷叶碱可逆转性改变高尿酸血症大鼠体内的葡萄糖载体9、肾尿酸盐转运体、有机阴离子/碱转运体以及ATP结合子等相关蛋白的表达;且能抑制髓样分化因子88、肾炎症信号受体和NF-κB信号通路的活性;该研究表明荷叶中的荷叶碱具有抑制和治疗肾脏炎症高尿血酸症的潜在功效;其抗高尿酸血症是通过调节高尿酸血症大鼠体内的有机离子转运以及调控信号通路的活性而发挥作用的。
Liao等[59]通过提取分离得到一种由多糖部分和蛋白部分构成的莲心胚芽糖蛋白,并证明其可以有效地抑制脂多糖激活小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7和释放炎症因子。莲子心富含的莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱等生物碱具有稳定大细胞、稳定细胞膜、合成NO和抑制白细胞分化抗原配体(leukocyte differentiation antigen,CD)80等刺激因子活性、抑制炎性因子及抗炎症等作用[60]。莲子心有助于提高IL-10的水平,从而起到抗炎症的作用[61]。
在三大生物碱(莲心碱、甲基莲心碱、异莲心碱)中,莲子心中甲基莲心碱含量最高,具有多种生物活性,如抗心肌缺血、降压作用、扩充血管、清除活性氧自由基、抗心律失常、抑制脂质过氧化作用,在医学上常用来治疗高血压、血栓、心律失常、有机磷中毒等慢性疾病,应用前景广阔[62]。Zhou Yajun等[63]研究结果表明,甲基莲心碱能降低由胶原蛋白、凝血酶U46619诱导的血小板致密颗粒的分泌,能够抑制凝血酶、胶原蛋白、二磷酸腺苷(adenosine diphosphates,ADP)诱导的富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)中血小板聚集或U46619诱导的血小板聚集,而且其还能促进凝血酶、胶原蛋白、ADP或U46619等血小板聚集激动剂的预形成和解离;因此说明甲基莲心碱具有很强抗血栓活性。甲基莲心碱还能明显延长电刺激大鼠颈动脉闭塞性血栓形成时间[64]。
Sugimoto等[65]对莲子心提取物分别用水层、正己烷、正丁醇和三氯甲烷进行萃取,经过小鼠实验,结果表明除三氯甲烷层外,均不能显著抑制小鼠的自发行动,三氯甲烷提取层中主要物质是生物碱甲基莲心碱,其可以很强烈地抑制小鼠的自发运动,还具有镇静作用,能显著延长硫喷妥钠诱导小鼠睡眠的时间。甲基莲心碱具有中枢抑制作用,其抗惊厥、抗焦虑的作用与地西泮相似,但作用机制不同;甲基莲心碱的主要作用机制可能与5-羟色胺能神经传递有关[66];地西泮抗焦虑作用的机制是地西泮作用于苯二氮卓类受体,药物与此类受体结合之后,该类受体被激活,继而增加γ-氨基丁酸A型(γ-aminobutyric acid type A,GABAA)受体对GABA的亲和力,GABAA受体又与Cl-通道偶联,激活的GABAA受体使Cl-通道得开放频率增加,从而使神经元膜超极化,神经元的兴奋性得以降低,进而发挥抗焦虑的药效[67]。
莲子心在标准治疗的基础上,可以降低不稳定性心绞痛患者的血清基质金属蛋白酶-9及基质金属蛋白酶抑制因子-1水平,从而改善患者的生存质量[68]。蛋白质二硫键既能抑制肿瘤细胞凋亡,又能促进肿瘤细胞浸润转移。莲子心中的主要生物碱成分莲心碱、甲基莲心碱、N-甲基乌药碱、异莲心碱对蛋白质二硫键异构酶活性均具有抑制作用,其中N-甲基乌药碱活性最强[69]。5α-还原酶在还原型辅酶Ⅱ的参与下将睾酮催化转变为双氢睾酮,是治疗前列腺增生的药物之一。巫传玲等[70]的研究结果表明,莲子心提取物中莲心碱和甲基莲心碱对5α-还原酶具有抑制作用,可见莲子心提取物可用于临床治疗前列腺增生。Yajima[71]的研究结果表明莲子心黄酮通过调节β-肾上腺素可实现抑制脂肪吸收的作用。
莲子心是一种宝贵的天然资源,可涩精、止血、去热清心,具有多方面的药用和保健价值。可以尝试将双水相辅助法、闪式提取法、动态逆流提取法等技术运用于莲子心主要化学成分的提取,考察新技术的运用能否更有利于莲子心主要化学成分的提取。随着对莲子心生物碱及其他有效成分研究的深入,莲子心生物碱作为合成药物的先导化合物的价值逐渐被人们认识到,如莲子心中双苄基异喹啉类生物碱具有显著的抗心律失常、降压、抗心肌缺血等药理活性的机制已成为现代医药研究热点之一。今后可对莲子心以下方面展开进一步研究:莲子心萃取物在抗肝纤维化效果的分子水平上的作用机制、莲子心抗肿瘤作用的动物实验验证、莲子心抗肿瘤活性成分及分子作用机制、莲子心水溶性次生代谢产物(多是黄酮和黄酮苷类化合物)的构效关系。