配合饲料和血液对菲牛蛭水蛭素活性及非特异性免疫指标的影响

■熊 伟 秦国兵 姚俊杰王 雪 唐 鑫

(贵州大学动物科学学院水产科学系贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳550025)

菲牛蛭（Poecilobdella manillensis）是吸血类水蛭的一种，俗名金边蚂蟥、马尼拉医蛭，隶属环节动物门（Annelida）医蛭科（Hirudinidae）牛蛭属（Poecilobdella Whitman）。菲牛蛭具有水蛭素(hirudin)、纤维蛋白溶解酶、抗血小板聚集成分和抑菌成分等多种活性成分，水蛭素是最主要的活性组分[1]。现代医学表明，水蛭素在心脑血管疾病、动脉粥样硬化、败血休克、高血压以及缺少抗凝血酶Ⅲ因子等疾病方面具有巨大的优越性和广阔的应用前景[2-3]。由于过度的捕捞及生态环境恶化等诸多原因的影响，菲牛蛭资源急剧下降。因此，人们在探究菲牛蛭人工养殖方法，其中用配合饲料养殖也是人们关注的热点。

近年来，人们从菲牛蛭摄食与生长[4]、养殖方式[5]、病害防治[6]、繁殖[7]等方面做了很多工作，菲牛蛭的人工繁殖也取得成功。但是菲牛蛭还是采用粗放式的血液投喂，而血液的不易获得、易腐败、易污染、质量不稳定等缺点，给养殖户带来诸多不便，限制了菲牛蛭的规模化养殖。因此，研究菲牛蛭的人工配合饲料是急待解决的问题。菲牛蛭以动物性血液为食，2014年李军等[8]报道了菲牛蛭可以摄食配合饲料。相关研究表明饵料的改变会引起抗免疫相关酶的改变[9]，同时能刺激免疫应答，保护机体免受损伤[10]。而配合饲料养殖条件下，菲牛蛭免疫能力和水蛭素活性是否受到影响是值得我们探索的问题。所以，本研究采用鸡血和自制配合饲料对菲牛蛭进行饲养，从水蛭素活性和非特异性免疫指标两个方面对配合饲料做出评价，以期为规模化养殖菲牛蛭提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菲牛蛭购买于贵州蛭臻宝生物科技有限公司。随机挑选大小均匀、体格健壮且体表无病，平均体重为（2.83±0.71）g，平均体长（5.33±0.54）cm的菲牛蛭幼苗。配合饲料主要成分和含量为：血球蛋白（NP-90，4%）、血浆蛋白（NP-2002，5%）、氯化钠（2 g）、L-精氨酸（0.175 g）、维生素C(0.2 g)，加入纯净水到1 000 ml；血液采用菜市场收集的鸡血（不加盐、不加水），打浆机打成血浆；灌肠投喂。试验用水采用花溪河河水，pH值7.5～7.8，水温20～26 ℃，溶解氧6～9 mg/l。试验在塑料大棚中进行，养殖箱规格为35 cm×25 cm×20 cm，为防逃采用筛娟网密封，并在筛娟网上装置拉链方便饲养及换水。

1.2 试验设计

试验设置2个组，配合饲料组和血液组，每个组3个重复。养殖密度为40尾/箱。试验组采用自制配合饲料灌入风干猪血肠衣中投喂，对照组采用鸡血打成血浆灌入风干猪血肠衣中投喂，养殖周期60 d，投喂频率为每3 d 1次，每天换水量50%，停饲1周采样。

1.3 样品采集

每个重复随机抽取28尾菲水蛭，取3尾直接放入-80℃冰箱冻存，用于水蛭素活性测定。剩余25尾置于冰上解剖取肠道及嗉囊组织，取样菲牛蛭结构图参照高胜涛[11]（取样编号：配合饲料组，嗉囊记为“ss”，肠道记为“sc”；血液组，嗉囊记为“xs”，肠道记为“xc”）。样品置于-80℃冰箱保存备用。

1.4 指标测定

组织蛋白、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LSZ）试剂盒均购买于南京建成生物工程研究院。水蛭素活性测定采用《中国药典》2010版规定的测定方法及陈华友等[12]提供的方法（数据体现时，在相应标号前增加指标英文缩写，如“LSZss”代表配合饲料组嗉囊组织中溶菌酶的活力）。

1.5 数据分析

数据结果采用SPSS 19.0进行统计分析，所得结果以“平均值±标准差”表示。运用LSD和Duncan's法检验进行多重比较。P＜0.05认为有显著差异。

2 结果

2.1 配合饲料和血液饲养对饲养菲牛蛭水蛭素活性的影响（见表1）

表1 配合饲料和血液饲养对菲牛蛭水蛭素活性的影响（U/g）

由表1可知，血液组水蛭素活性为(76.171 9±0.390 6)U/g，配合饲料组水蛭素活性为(75.390 6±0.391 8)U/g。血液组水蛭素活性略高于配合饲料组，但在统计学意义上，差异性不显著（P＞0.05）。

2.2 配合饲料和血液饲养对菲牛蛭免疫指标的影响

配合饲料和血液饲养对菲牛蛭溶菌酶（LSZ）的影响见图1。配合饲料组肠道LSZ活力显著低于血液组（P＜0.05），LSZ活力分别为（13.119±1.321）U/mg prot.和（62.104±6.146）U/mg prot.；配合饲料组嗉囔LSZ活力稍低于血液组，差异性不显著（P＞0.05），LSZ活力分别为（30.223±5.642）U/mg prot.和（39.962±6.014）U/mg prot.。

配合饲料和血液饲养对菲牛蛭碱性磷酸酶（AKP）的影响见图2。配合饲料组肠道AKP活力显著高于血液组（P＜0.05），AKP活力分别为（148.317±8.144）U/mg prot.和（18.664±1.627）U/mg prot.；配合饲料组嗉囔AKP活性稍高于血液组，差异性不显著（P＞0.05），AKP活力分别为(14.333±1.154)U/mg prot.和(6.333±0.577)U/mg prot.。

配合饲料和血液饲养对菲牛蛭酸性磷酸酶（ACP）的影响见图3。配合饲料组肠道ACP活力（298.478±4.212）U/mg prot.显著高于血液组ACP活力（67.591±5.384）U/mg prot.（P＜0.05）；配合饲料组嗉囔ACP活力（25.926±0.512）U/mg prot.稍高于血液组ACP活力（17.012±1.235）U/mg prot.，差异性不显著（P＞0.05）。

图1 配合饲料和血液饲养对菲牛蛭的溶菌酶活力影响

图2 配合饲料和血液饲养对菲牛蛭的碱性磷酸酶活力影响

图3 配合饲料和血液饲养对菲牛蛭的酸性磷酸酶活力影响

3 讨论

3.1 配合饲料和血液饲养对菲牛蛭水蛭素活性的影响分析

水蛭素是水蛭唾液腺分泌物中的一种蛋白质，是迄今发现的最强的天然凝血酶特效抑制剂，是活血化淤的通经良药[13]。菲牛蛭具有多种活性成分，如菲牛蛭素、纤维蛋白溶解酶、抗血小板聚集成分和抑菌成分等，而最主要的活性成分为水蛭素（菲牛蛭素）[1]。在菲牛蛭养殖中，水蛭素活性作为菲牛蛭养殖产品质量的评判标准。在贵州养殖条件下，本实验室朱忠胜[14]得出幼体菲牛蛭水蛭素活性为(73.24±3.65)U/g。本试验中，水蛭素活性血液组为(76.171 9±0.390 6)U/g，配合饲料组为(75.390 6±0.391 8)U/g，在统计学意义上，血液组和配合饲料组水蛭素活性无显著差异（P＞0.05）。表明在养殖周期为60 d，配合饲料对菲牛蛭水蛭素活性无影响。说明人工配合饲料可以替代自然的血液饲料。

3.2 配合饲料和血液饲养对菲牛蛭LSZ的影响分析

溶菌酶(LSZ)可以分解连接N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）残基之间的β-1，4糖苷键，破坏肽聚糖支架，导致细菌细胞壁破裂、内含物逸出而使细菌溶解死亡，是许多生物先天性免疫系统的重要组成成分。LSZ广泛存在植物、无脊椎动物和高等动物，依赖于物种表现出了严格且特异的时空表达模式[15]。在鱼类中，溶菌酶广泛存在于脾脏、肾脏、头肾、皮肤、心脏、肠和血液中[16]。而关于菲牛蛭溶菌酶存在鲜有报道，本试验在菲牛蛭肠道及嗉囊组织中均检测到溶菌酶活力。

菲牛蛭属于吸血类水蛭，一次吸血量能达到身体体积的3倍左右，半年不摄食不影响其生理功能，吸食的血液保存在嗉囊中。而血液易变质，容易滋生腐败细菌，但在菲牛蛭体内能保存完好，主要是溶菌酶的作用。溶菌酶是国内外研究较早、较多的一种酶类生物保鲜剂，能抑制其体内酶活性，阻止易引起水产品腐败变质的微生物生长繁殖，延缓腐败进程[17]。相关研究表明塞内加尔鳎感染发光菌后脾脏、头肾和肝脏中溶菌酶含量增加[18]；牙鲆经爱德华氏菌感染后溶菌酶表达量在心脏、肠和血液中显著提高[19]。菲牛蛭摄食配合饲料后，肠道组织中配合饲料组显著低于血液组，嗉囊组织中LSZ活力配合饲料组稍低于血液组，降低了菲牛蛭的LSZ活力。形成这一结果的可能原因是菲牛蛭本身具有的溶菌酶对摄入食物有一定的保存作用，当血液变质滋生腐败细菌时，促进溶菌酶含量上调，更能有效地杀灭有害细菌，保证食物血液的消化吸收；而配合饲料在加工上经过高温灭菌，不易滋生腐败细菌，不促进溶菌酶含量的上调，使溶菌酶含量处于一个较低水平。

3.3 配合饲料和血液饲养对菲牛蛭ACP和AKP的影响分析

碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）是两种非特异免疫酶，参与磷酸酶基团代谢与转移。AKP催化磷酸基团的转移反应，催化磷酸单酯的水解反应；ACP是溶酶体的标志酶，主要定位于溶酶体和内膜系统。对外源异物的磷酸酯外表面进行水解作用，在免疫反应中发挥重要的作用[20-21]。同时，AKP和ACP与水产动物机体的生长密切相关，在鱼体营养的吸收、利用中发挥着重要的作用[22]。饲料中添加甘露聚糖酶[23]、壳聚糖[24]等对水产动物AKP和ACP活力有促进作用，而环境的胁迫（pH值、盐度、运输等）会导致AKP和ACP活力下降。在菲牛蛭肠道组织中配合饲料组AKP和ACP活力显著高于血液组，嗉囊组织中配合饲料组AKP和ACP活力稍高于血液组。从AKP和ACP活力上看，配合饲料饲养菲牛蛭能达到或超过血液饲养水平。

菲牛蛭属于吸血类水蛭，嗉囊的功能主要是贮藏食物，消化吸收的能力较弱；而菲牛蛭肠道是主要的消化吸收的场所。磷酸酶普遍存在于动物的各组织中，如肠组织碱性磷酸酶、胎盘碱性磷酸酶和生殖细胞碱性磷酸酶等。肠组织AKP在保持肠道平衡中发挥重要作用，饲料可以影响它的活力，具有参与调节碳酸氢盐分泌和十二指肠pH值、通过脱磷酸作用控制细菌内毒素诱发的肠道炎症等功能[25]。凡是物质交换、吸收运转旺盛的器官中，都显示出AKP的高活力[26]。ACP参与磷酸酯的代谢，还参与能量转换以及信号传导等重要生命活动。本研究中血液和配合饲料情况下，肠道组织中AKP和ACP活力均显著高于嗉囊组织（P＜0.05），可能原因为菲牛蛭肠道的物质交换、吸收运转旺盛程度高于嗉囊，导致菲牛蛭肠道组织中AKP和ACP活力均显著高于嗉囊组织中AKP和ACP活力。