动物源性食品中氯霉素残留的快速筛查方法

陈军

(苏州出入境检验检疫局，江苏 苏州 215021）

0 引 言

氯霉素作为一种杀灭或抑制细菌生长的药物，曾在一段时间内作为饲料添加剂和兽医临床常用药品，因其通过水产品、肉制品、奶、蛋等对人体产生严重的毒副作用[1]，因而美国和欧共体已禁止在动物饲料中使用氯霉素，并规定在动物源食品中不得检出[2]。有关氯霉素在水产品、畜产品中残留的检测方法，国内外报道很多，包括微生物法[3-5]、色谱法[6-8]、免疫测定法[9-10]等，新型生物学检测技术的发展催生了生物膜干涉技术[11-15]。本文提出一种针对动物源性食品中氯霉素残留检测的免疫分析方法，以氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS)为母体直接偶联物固着在光纤探头表面，再由光纤光谱分析装置检测和识别待测样品中是否存在目标物以及浓度信息，实现样品中氯霉素的定量检测。

1 实验

1.1 仪器

Octet®RED 96 System生物分子相互作用仪，紫外可见分光光度仪，旋转蒸发仪，冷冻离心机，台式冷冻离心机，台式真空泵，磁力搅拌器。

1.2 试剂

牛血清白蛋白(BSA)，电泳纯（进口分装）；人血清白蛋白(HSA)，电泳纯（进口分装）；氯霉素(CAP)，琥珀酸酐(HS，化学纯），三正丁胺（化学纯），氯甲酸乙酯（化学纯），其他试剂均为AR级。

1.3 方法

1.3.1 免疫原和包被原的制备

（1）氯霉素半琥珀酸酯制备。将CAP、HS、丙酮、吡啶按适当比例混合、搅拌溶解，58～60℃回流2 h，浓缩、蒸去丙酮，加乙酸乙酯和稀盐酸振荡去酸层，用10%NaHCO3转溶，加浓盐酸调pH值到3，析出糖浆状物，再用酸乙酯萃取，取有机相旋转蒸发器浓缩，得氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS)，备用。

（2）氯霉素包被原制备。称取CAP-HS 21.7 mg溶于3 mL DMF中，4℃预冷10 min，依次加入三丁胺、氯甲酸异丁酯，4℃搅拌20 min；按50∶1的摩尔比(CAP/BSA)称取BSA，溶于50%的DMF 10 mL中，4℃预冷，用1 mol/L的NaOH调BSA至p H值为8；将前述CAP-HS液迅速加入BSA中，4℃搅拌反应4 h。所得产物以0.05 mol/L pH7.4的PBS透析3 d，得氯霉素包被原Hap-BSA。

（3）氯霉素免疫原制备。称取48 mg OVA和10 mg氯霉素溶在5 mL冰冷的0.05 mol硼砂缓冲液(pH 8.5，含0.15 mol NaCl)中，4℃搅拌，将所得1.5 mL溶液逐滴加入到该溶液中，避光反应1 h，得氯霉素包被抗原Hap-OVA。

（4）金标氯霉素包被原制备。向1 mL胶体金中加入1μL质量浓度为0.5 g/L的氯霉素抗体，涡旋混匀，室温静置15 min，加入100μL质量分数为10%的BSA浓液，室温封闭颗粒15 min，在转速为10 000 r/min下离心10 min，弃掉上层清液，加入90μL PB(pH=7.4)，重悬颗粒，备用。

1.3.2 光纤生物传感器的制备

将APS光纤传感器末端置于不同浓度的氯霉素-BSA偶联物溶液中，室温静置5 min后再将光纤生物传感器没入质量分数为15%蔗糖中，室温静置1 min。室温晾干，置于2～8℃下干燥保存。

1.3.3 牛乳中氯霉素残留检测

采用无标记检测和胶体金标记检测2种方式对牛乳中氯霉素残留进行检测。

(1)无标记BLI检测。将光纤传感器末端没入空白奶液中(200μL牛乳+50μL缓冲液)中120 s进行平衡，再将光纤传感器末端没入末端置于待测奶液(200 μL待测牛乳+50μL缓冲液+2μg氯霉素单克隆抗体)中300 s检测牛乳中氯霉素残留量。

(2)金标记BLI检测。将光纤传感器末端置于奶液中(200μL牛乳+50μL缓冲液+5μL金标BSA)中平衡120 s;然后，将光纤传感器末端没入待测奶液(200μL待测牛乳+50μL缓冲液+5μL金标氯霉素素单克隆抗体)中700 s。检测牛乳中氯霉素残留量。

1.3.4 胶体金免疫层析检测

使用胶体金试纸条检测梯度稀释的添加氯霉素的牛乳样品，每个浓度重复3次，具体操作参照牛乳中氯霉素快速检测试纸条说明书进行。

2 结果与分析

2.1 灵敏度实验

(1)无标记BLI检测。用巴氏杀菌奶将该抗体稀释成质量浓度为0.1 ng/mL的牛奶样本检测结果，然后用该液体将氯霉素标准品质量浓度稀释到100，50，25，12.5，6.25，3.12 ng/mL和 0 ng/mL，进行无标记BLI检测上机检测，结果表明灵敏度为2.0 ng/mL(图1)。

图1 无标记BLI检测牛奶中氯霉素残留实验结果

(2)金标记BLI检测。用氯霉素阴性巴氏杀菌奶将氯霉素标准品稀释至100，50，25，12.5，6.25，3.12 ng/mL和0 ng/mL。采用金标记BLI检测，检测灵敏度为0.0125 ng/mL(见图2)，图3为重复检测6次氯霉素质量浓度为0.1ng/mL的牛奶样本检测结果。

图2 金标记BLI检测牛乳中氯霉素残留实验结果

图3 金标记BLI重复检测氯霉素加标样品

由图3可以看出，采用金标记信号放大技术建立了检测样品中四环素类抗生素残留的方法，说明方法具有良好的灵敏性，可适用于四环素类抗生素残留的快速定量检测。

2.2 氯霉素特异性试验

用建立的金标记BLI方法检测加标质量浓度为1 000 ng/mL的三聚氰胺、头孢哌酮、恩诺沙星、青霉素G、安苄青霉素、头孢哌酮、氟苯尼考和甲砜霉素，检测结果均为阴性。说明所制备的单抗对氯霉素具有一定的特异性。

2.3 基质对灵敏度的影响

分别用6份原奶、7份来自不同批次的巴氏杀菌奶倍比稀释氯霉素标准品，分别采用金标记BLI检测方式进行检测，灵敏性稳定达到0.0125 ng/mL。

2.4 实际样品中氯霉素残留检测结果

使用氯霉素快速检测试纸条及LC-MS/MS评价金标记BLI方法的可靠性，检测20份两个加标水平的牛乳样品中氯霉素残留，金标记BLI与所采用的对照方法的结果见表1，其灵敏度优于胶体免疫层析试纸条，检测结果与LC-MS/MS一致。

表1 金标记BLI、胶体金免疫层析试纸条及LC-MS/MS检测牛乳加标氯霉素残留 ng/mL

3 讨 论

利用生物膜干涉技术建立快速检测动物源性食物样品中氯霉素残留的快速筛查方法。本实验采用胶体金信号放大检测牛奶中的氯霉素，建立了一种快速检测动物源性食品中氯霉素残留的方法，其检测灵敏性在0.0125 ng/mL以下，与恩诺沙星、三聚氰胺、青霉素G、安苄青霉素、头孢哌酮、氟苯尼考和甲砜霉素等无交叉反应。该试验结果表明采用相同的抗原、抗体、纳米金、缓冲液及纳米金标记抗体工艺，金标记生物膜干涉技术检测氯霉素残留的灵敏性要明显高于免疫层析试纸条的灵敏性，其检测结果与经典仪器分析一致。

该试验表明采用金标记BLI技术检测牛乳中抗生素残留竞争结合反应需要90 min以上的时间方能达到平台期，在90 min以内虽然检测信号一直在提高，但在反应初期即可对阴阳性结果进行判定。另外，该研究中金标记BLI检测喹诺酮类抗生素的定量范围较小，并不适用于实际生产中的定量检测，是一种较好的定性检测方法。笔者建立的方法虽然检测周期略长于免疫层析试纸条方法(6 min)，但仍是一种简便、快捷的检测方法，可以用于牛乳中喹诺酮类抗生素残留的快速检测。

该方法还具有良好的特异性，与牛乳中常见的其他小分子物质无交叉反应。不同人员采用笔者所建立的方法检测氟甲喹加标牛乳样品，灵敏度无显著差异，说明该方法具有良好的稳定性。金标记生物膜干涉检测技术具有良好的抗干扰能力，不同的样品基质对于检测的灵敏性的干扰并不明显，检测不同牛乳中氯霉素的灵敏性均达到2.0 ng/mL。

4 结 论

采用金标记信号放大技术建立了检测牛奶中氯霉素类抗生素残留的方法，该方法具有良好的特异性及灵敏性，适用于牛奶中氯霉素残留的快速定量检测，检测灵敏性在0.0125 ng/mL以下，与恩诺沙星、三聚氰胺、青霉素G、安苄青霉素、头孢哌酮、氟苯尼考和甲砜霉素等无交叉反应。