疑似A型猪内源性逆转录病毒致肿瘤病例

孙伟峰,王 贞,梁静泊,刘海坤,马誉芸,盖新娜,郭 鑫

（中国农业大学动物医学院 农业部动物流行病学重点实验室,北京 海淀 100193）

2018年1月,河北某猪场57日龄左右仔猪群出现批量死亡,个别表现神经症状。猪场曾进行过猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒及沙门菌的常规疫苗免疫。在病死仔猪剖检过程中,发现1头仔猪的胸、腹腔内,尤其是肾脏、脊柱两侧,布满了大量、大小不等的白色肿瘤结节。该仔猪肺脏、肾脏、腹股沟淋巴结中PRRSV、CSFV、PRV等病原的核酸检测结果均为阴性。我们对该病例进行了进一步的病原检测,现报告如下。

1 大体剖检病变

死亡仔猪外观未发现皮肤出血、发绀等病理现象。剖开仔猪胸、腹腔后可观察到其肺门淋巴结上布满灰白色的结节状突起;沿脊柱两侧肿瘤数量较多,分布集中（见中插彩版图1B中黑色箭头所示）;整个肾脏表面布满突出表面的白色肿瘤结节（见中插彩版图1A）。

2 病理切片观察

将病变的肾脏组织制成病理切片（见中插彩版图2）。在低倍镜下可见,病变肾脏的基本结构已破坏,部分肾小管已坏死崩解（见中插彩版图2B中黑色箭头所示）,大量肿瘤细胞沿肾小管间隙呈浸润式生长（见中插彩版图2A中黑色箭头所示）;部分区域肿瘤细胞已完全取代正常肾组织（见中插彩版图2A中白色箭头所示）。肾小管上皮细胞重度水泡变性（见中插彩版图2C中黑色箭头所示）,肿瘤细胞为大、中、小淋巴细胞,形态多样,核分裂相多见（见中插彩版图2D中黑色箭头所示）。

3 病原检测

取肿瘤组织进行研磨,提取总RNA,去除gDNA后进行反转录。用特异性引物进行PCR扩增（上游引物:5′-ATGCATCCCACGTTAAGCTGGC-3′,下游引物:5′-CTAGAGGTCAGTTTCTCCTTGGCTC-3′, 扩 增片段长度约2 kb）。经琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增条带大小相符后（见中插彩版图3）,切胶回收目的条带,连接到p-EASY-blunt载体上,将重组质粒转化入Trans-10感受态细胞,挑选阳性克隆进行序列测定。

序列比对结果显示,扩增得到的序列与A型猪内源性逆转录病毒囊膜（PERV-A-env）基因序列的同源性达99%。

综合病猪的大体病变情况、肾脏组织病理学变化及病原核酸检测结果,判断该病例疑似为由PERV-A感染引起的淋巴肉瘤。

图3 env基因的PCR扩增

4 讨论

PERV属于逆转录病毒科正逆转录病毒亚科γ逆转录病毒属,为哺乳动物类C型逆转录病毒,与猫白血病毒（Feline leukemia virus,FeLV）等同源性很高[1-2]。其基因组包括核心蛋白基因（pol）、多聚酶基因（gag）和囊膜基因（env）以及位于两端的长末端重复序列（Long terminal repeat,LTR）,根据env基因的差异和体外细胞嗜性可将该病毒进一步分为 PERV-A、PERV-B和 PERV-C三个亚型[3]。

PCR检测证实,中国小型猪基因组内普遍含有PERV前病毒基因,阳性率达100%,且普遍存在两种以上亚型同时存在的现象。RT-PCR检测证实,大部分实验猪体内均存在PERV-A和PERV-B,但尚未检测到PERV-C复制的猪群[4]。有学者对大白猪不同器官中PERV的3种结构基因进行半定量RT-PCR检测,结果显示,病毒基因在肾脏和肝脏中的拷贝数最多[5]。猪被认为是人体器官移植的最佳供体,但其基因组内携带的PERV前病毒基因在体外可感染HEK-293等多种人类细胞[6]。Lj等将健康成年猪的胰腺移植到裸鼠体内后可在裸鼠的多个脏器内检测到PERV感染,证实PERV可经器官移植传播并导致受体动物发病[7]。PERV也因此引起了研究人员的重视。

由于诱发肿瘤的因素非常复杂,病程较长,该病在临床中难以发现,多见于屠宰场。PERV感染细胞后,单链RNA在逆转录酶的指导下合成双链DNA中间体并整合到宿主细胞基因组内,随宿主细胞染色体复制而复制,并可通过精液垂直传播[8-9]。虽然刺激整合到宿主基因组内的前病毒基因产生感染性病毒粒子的因素尚未完全清楚,但该病的发生与猪的品种、个体差异及饲养管理水平差等因素有一定的关联。

为监控及预防肿瘤的发生,养殖场应该加强饲养管理,提供充足的营养并饲喂不含致癌物质的饲料,以强化机体的免疫系统,增强抵抗疾病的能力;同时,做好诊断工作,当发现疑似PERV感染引发肿瘤的个体时应及时扑杀。未来,有望通过基因编辑技术去除猪基因组内的前病毒基因,以防止病毒基因通过垂直传播危害后代仔猪群。