冠心病相关基因的生物信息学分析

吴家炎 袁振光 陈依敏

【摘 要】 目的：采用生物信息学的方法来分析冠心病相关的基因，通路，转录因子和miRNA。方法：从公共基因芯片数据库GEO下载冠心病基因表达谱数据，筛选出差异表达基因（DEGs），并对差异基因进行GO、KEGG以及PPI网络分析。最后利用Webgestalt预测CHD相关的miRNA以及转录因子，并构建miRNA-TF-gene调控网络。结果：共筛选出1449个DEGs。GO功能分析发现DEGs主要参与炎症反应、细胞 - 细胞信号传导、神经肽信号通路等生物学过程。KEGG通路富集分析发现DEGs参与神经活性配体 - 受体相互作用、蛋白质的消化和吸收、维生素的消化吸收等通路。并且筛选出20个与冠心病发病相关的基因，特别是发现了少有文献报道的POMC、MYOD1等基因。最后我们还预测了与CHD相关的7个转录因子和3个miRNA。结论：通过生物信息学对基因芯片数据的分析，我们得到了冠心病相关的基因、通路、miRNA以及转录因子，为冠心病的精准治疗提供了新思路。

【关键词】 冠心病；生物信息学；差异表达基因 ；miRNA；转录因子

【中图分类号】 R249 【文献标志码】A 【文章编号】1005-0019（2018）17-001-01

冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease，CHD） 是由于冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄或阻塞导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病，简称为冠心病，是 21 世纪威胁人类健康的主要疾病之一 [1]。冠心病的发生和发展是在遗传因素和环境因素基础上，多重危险因素共同作用导致的[2]。高血压、糖尿病等疾病，以及过度肥胖、不良生活习惯如吸烟等是诱发该病的主要因素。冠心病是全球死亡率最高的疾病之一[3]，目前对冠心病发病的遗传因素还不清楚，对其基因方面的研究相对不足。

近年来，生物信息学发展迅速，为疾病在基因方面的研究提供了非常广阔的平台。生物信息学（Bioinformatics）是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。它是当今生命科学和自然科学的重大前沿领域之一，同时也是21世纪自然科学的核心领域之一。本文从GEO 数据库下载冠心病相关基因表达谱数据，为在基因层次上研究冠心病的发生发展及其精准治疗提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料来源 利用美国国立生物技术信息中心NCBI平 台 下 的GEO 数据库进行芯片筛选，目标芯片需满足如下筛选标准：①人类标本，排除细胞株和动物；②入选芯片需具有冠心病信息；③需为基因表达芯片，各探针具有归一化的表达值； 经筛选及芯片质量分析，我们选取了6个样本：冠心病CHD3例和健康对照组3例。

1.2 方法

1.2.1 差异基因筛选 下载CEL格式原始数据，利用R软件包affy进行读取，采用RMA方法进行数据标准化预处理（包括Background correction， Normalization， Expression calculation），利用平台注释文件对探针进行注释，去除没有匹配到基因的探针；对于不同探针映射到同一基因，我们取不同探针的均值作为这个基因最终的表达值。基于R包limma筛选差异表达基因，采用矫正T检验计算基因表达显著性P值，BH方法矫正P值。每个差异表达基因，要求P<0.05。

1.2.2 差异表达基因功能分析 使用常用的富集分析工具DAVID分析差异表达基因参与的GO（gene ontology） 功能和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes） 通路。参数富集基因个数count>=2，超几何检验显著性阈值P <0.05。

1.2.3 差异表达基因的PPI网络分析 使用STRING数据库预测分析所有差异表达基因的差异蛋白的PPI网络，PPI网络可揭示蛋白之间的互作关系。构建网络软件为Cytoscape。并统计节点degree值，观察节点之间的连接情况。

1.2.4 miRNA-TF-gene调控网络 利用webgestalt网站分别对差异基因进行转录因子TF富集预测和miRNA富集预测。取富集结果显著的TF和miRNA。并整理TF-gene和miRNA-gene关系对，构建miRNA-TF-gene调控网络。

2 结果

2.1 差异表达基因筛选结果 最终我们共筛选出1449个差异基因，与对照组相比，冠心病样品组得到726个上调基因，723个下调基因。

2.2 GO功能和KEGG通路富集分析 通过G0功能分类体系对差异基因进行注释后发现，显著富集的生物过程GO富集分析发现DEGs主要参与炎症反应、细胞-细胞信号转导、

神经肽信号通路、G蛋白偶联受体-环核苷酸通路、G蛋白偶联受体-蛋白信号通路的正调控等生物学过程。以KEGG数据库中的pathway为基本单位，向背景基因组映射，明确差异基因所参与的主要代谢途径和细胞转导通路，结果表明差异基因显著富集于神經活性配体-受体相互作用、蛋白质的消化和吸收、黑素瘤、维生素的消化吸收、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、脂肪的消化吸收等具有统计学意义的通路。

2.3 PPI网络分析 结合PPI数据库，分别对上调差异基因和下调差异基因构建网络图，得到的PPI网络。上调ppi网络包括392个节点，下调ppi网络包括419个节点。上调基因按照节点度大小排名的top 20 ，见表1。此处插入表12.4 miRNA-TF-gene调控网络：通过Webgestalt，我们找到富集结果排名前七的转录因子TF：PAX8、EVI1、AR、NRSF、GATA、IK1、MYOD，以及排名前三的miRNA：MIR-26A/B，MIR-29A/B/C，MIR-122A。整理相应的TF和miRNA的靶基因，构建miRNA-TF-gene调控网络，见图1。

3 讨论

目前对冠心病的发病机制，还不是特别的清楚。根据文献报道，炎症反应对冠状动脉形成粥样硬化具有重要的作用。Luczak[4]FanWH[5]杨海燕[6]等研究表明，慢性炎症反应导致细胞产生黏附分子，是动脉粥样硬化的始动环节；同时炎症指标可用来预测心血管疾病的發生。但是目前在基因水平上对该病的了解还是非常的有限，因此本研究对正常人和冠心病患者的表达谱进行差异基因筛选，共筛选出1449个差异基因。利用string 在线软件对1449个差异基因编码蛋白进行蛋白质互相作用关系网络分析，按节点度大小筛选出排名前20的上调基因：POMC、FPR2、MYOD1、GATA1、C3、GRM4、DRD4、SSTR5、PYY、FGF13、RGS6、CXCR1、、CCR10、SSTR4、CNR2、GALR3、APLN、NPBWR1、CDX2、PTGDR2。

对以上基因进行文献挖掘，我们发现已有大量的文献报道APLN、CXCR1、C3、FPR2与冠心病的发生、发展的机制以及预后关系密切 ；NR2、PYY、NPBWR1、PTGDR2与冠心病发生的危险因素有关，比如：糖尿病、高血压、肥胖；POMC、MYOD1等至今少有跟冠心病相关的报道。Guang Yang等研究表明，载脂蛋白C3单核苷酸多态性增加了冠心病的发生风险[7] ；Ye zhang等认为CXCR1通过抑制内皮细胞转移，使冠心病发生的风险增加[8]；CAPLN是APJ受体的内源性肽配体，已经成为心血管系统的新型调节剂，APLN的缺乏使血管和内皮祖细胞生成减少，从而体内心肌血管生成受损，同时也会增加对缺血性损伤的易感性，这也增加了冠心病发作的风险[9]。值得一提的是，我们发现POMC、MYOD1等基因与冠心病之间的关系报道较少。MyoD1基因，别名MYF3，是一种蛋白质编码基因。Davis等人在1987年通过与小鼠MyoD1探针的弱交叉杂交分离出3种不同的人肌源性因子MYF3，MYF4和MYF5的cDNA，证明MYF3是小鼠MyoD1的人类同系物。Weintraub等人在1991年研究发现MyoD1仅在骨骼肌及其前体中表达，在非肌肉细胞中，基因被特定基因所抑制。但这与冠心病的发生发展还需进一步的研究。

值得一提是，我们还利用Webgestalt和Cytoscape构建了miRNA-TF-gene调控网络。Webgestalt的富集结果中，我们得到与CHD关系最为密切的7个转录因子：PAX8、EVI1、AR、NRSF、GATA、IK1、MYOD，以及3个miRNA：MIR-26A/B，MIR-29A/B/C，MIR-122A。

总之，通过生物信息学方法对冠心病芯片进行数据挖掘，我们得到了冠心病患者和正常健康人之间的差异表达基因。对这些差异表达基因的进一步筛选得到包括MYOD1和POMC在内的20个关键基因；同时我们发现炎症反应、维生素的消化吸收等过程和神经活性配体 - 受体相互作用等通路；最后我们进一步研究发现了一些与CHD相关的转录因子和miRNA：PAX8、EVI1、AR、MIR-26A/B、MIR-29A/B/C，MIR-122A。这些基因，转录因子和miRNA可能在CHD的发病机制中发挥重要的作用，但是具体的作用机制还需要进一步的实验来探讨，这对于CHD以后的精准治疗具有一定的临床意义

参考文献

[1] 杨天，王莉娜，智宏，等. 冠心病合并糖尿病与单纯冠心病危险因素及临床特点比较研究[J]. 南京医科大学学报（自然科学版），2014（09）：1218-1223.

[2] 高阅春，何继强，姜腾勇，等. 冠心病患者冠状动脉病变严重程度与冠心病危险因素的相关分析[J]. 中国循环杂志，2012（03）：178-181.

[3] 谢睿彬，张小新，苏华，等. 不同类型冠心病介入治疗的研究进展[J]. 中国医学创新，2013（15）：158-159.

[4] Luczak S E， Smits S H， Decker C， et al. The Chlamydia pneumoniae Adhesin Pmp21 Forms Oligomers with Adhesive Properties[J]. J Biol Chem，2016，291（43）：22806-22818.

[5] Fan W H， Liu D L， Xiao L M， et al. Coronary heart disease and chronic periodontitis： is polymorphism of interleukin-6 gene the common risk factor in a Chinese population？[J]. Oral Dis，2011，17（3）：270-276.

[6] 杨海燕，毛静飞，吴常裕，等. 肺炎衣原体感染及炎症反应与冠心病的关系[J]. 中华医院感染学杂志，2017（23）：5352-5356.

[7] Yang G， Lei M M， Yu C L， et al. Apolipoprotein A5 and apolipoprotein C3 single nucleotide polymorphisms are correlated with an increased risk of coronary heart disease： a case-control and meta-analysis study[J]. Lipids Health Dis，2015，14：113.

[8] Zeng Y， Shen Y， Huang X L， et al. Roles of mechanical force and CXCR1/CXCR2 in shear-stress-induced endothelial cell migration[J]. Eur Biophys J，2012，41（1）：13-25.

[9] Wang W， Mckinnie S M， Patel V B， et al. Loss of Apelin exacerbates myocardial infarction adverse remodeling and ischemia-reperfusion injury： therapeutic potential of synthetic Apelin analogues[J]. J Am Heart Assoc，2013，2（4）：e249.