正交试验优化超临界CO2流体萃取淮山多糖工艺

杨孝辉，郭 君

(湖南化工职业技术学院，湖南株洲 412004)

淮山在我国有广泛的种植，是传统的药食同源植物［1］。研究表明，淮山含有的淮山多糖具有降低血糖［2］、调节和增强免疫功能、抗氧化、抗衰老、抗突变作用［3］。目前淮山多糖的提取方法主要有热水浸提法、碱法提取［4］、酶辅助浸提法、微波辅助提取法［5］、超声波辅助提取法等［3］，这些方法提取温度高，使淮山多糖生物活性降低，同时使用的溶剂量较大，造成后续分离的困难。采用超临界CO2流体萃取淮山多糖，萃取温度低、所用萃取溶剂少，能够在保持多糖萃取物生物活性的同时降低后续分离难度。本试验以淮山多糖的萃取率为考察指标，在单因素试验的基础上采用正交试验优化超临界CO2流体萃取淮山多糖的萃取条件，为淮山多糖的进一步研究和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与试剂

淮山(购自株洲市湘天桥菜市场);HA121－50－01超临界萃取装置(江苏南通华安超临界萃取有限公司);UV－2550紫外可见分光光度计(岛津制作所);分析天平(岛津AUW220D);乙醚;无水葡萄糖;苯酚;硫酸。所用试剂均为分析纯，试验用水均为新制蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 淮山多糖的测定［6－7］

准确称取干燥至衡重的无水葡萄糖标准品1g，配成浓度为0.1mg/mL的葡萄糖对照品贮备液，从中分别精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 置于 25 mL 具塞试管中，各加水至 2.0 mL，各加5%苯酚溶液1.5 mL，振摇混匀，滴加硫酸5.0 mL，迅速振摇均匀，于50℃下放置30min，照紫外可见分光光度法于490nm波长下测定吸光度值，以样品浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为:y=6.2586x－0.0038，R2=0.9991。同法测定淮山提取物吸光度值，对照标准曲线计算淮山多糖含量，计算萃取率。

淮山多糖萃取率(%)=c×V/m×100

c:淮山多糖质量浓度;m:淮山样品质量(g);V:经超临界萃取所得萃取物样品溶液体积(mL)。

1.2.2 超临界CO2流体萃取淮山多糖单因素试验

1.2.2.1 淮山样品预处理

取新鲜的淮山去除杂质、洗净，60℃干燥至含水量小于5%，粉碎成40目的颗粒，用10倍量的乙醚浸提3次脱脂，样品挥去乙醚，干燥，备用。

1.2.2.2 超临界CO2流体萃取温度对淮山多糖萃取率的影响

分别称取经乙醚脱脂处理的40目淮山样品300g，固定萃取压力为35MPa、萃取时间为2h、夹带剂为100mL 90%乙醇，分别设定萃取温度为20、30、40、50、60℃进行萃取。萃取物按1.2.1方法测定淮山多糖，分别计算不同温度条件下淮山多糖的萃取率。

1.2.2.3 超临界CO2流体萃取压力对淮山多糖萃取率的影响

分别称取经乙醚脱脂处理的40目淮山样品300g，固定萃取温度为50℃、萃取时间为2h、夹带剂为100mL 90%乙醇，分别设定萃取压力为20、25、30、35、40 MPa进行萃取。萃取物按1.2.1方法测定淮山多糖，分别计算不同萃取压力条件下淮山多糖的萃取率。

1.2.2.4 超临界CO2流体萃取时间对淮山多糖萃取率的影响

分别称取经乙醚脱脂处理的40目淮山样品300g，固定萃取压力为35MPa、萃取温度为50℃、夹带剂为100 mL 90%乙醇，分别设定萃取时间为 1、1.5、2、2.5、3 h 进行萃取。萃取物按1.2.1方法测定淮山多糖，分别计算不同萃取时间条件下淮山多糖的萃取率。

1.2.2.5 超临界CO2流体萃取夹带剂用量对淮山多糖萃取率的影响

分别称取经乙醚脱脂处理的40目淮山样品300g，固定萃取压力为35MPa、萃取时间为2h、萃取温度为50℃，分别设定90%乙醇作为夹带剂的用量为 0、50、100、150、200mL进行萃取。萃取物按1.2.1方法测定淮山多糖，分别计算不同夹带剂用量条件下淮山多糖的萃取率。

1.2.2.6 淮山粒度对淮山多糖萃取率的影响

取新鲜的淮山去除杂质、洗净，60℃干燥至含水量小于5%，分别粉碎成粒度为10、30、50、70、90目的淮山颗粒，用10倍量的乙醚浸提3次脱脂，样品挥去乙醚，干燥;分别称取经乙醚脱脂处理的淮山样品300 g，固定萃取压力为35MPa、萃取时间为2 h、萃取温度为50℃，夹带剂为100 mL 90%乙醇，考察不同粒度样品其淮山多糖萃取率。

1.2.3 正交试验设计

根据单因素实验结果，选取超临界CO2流体萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂用量4个因素，每个因素设计3个水平，以淮山多糖萃取率为考察指标，按L9(34)正交表设计正交试验优化萃取工艺，正交试验的因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table1 Factors and levels for orthogonal array design

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超临界CO2流体萃取温度对淮山多糖萃取率的影响

图1 萃取温度对淮山多糖萃取率的影响Fig.1 The relationship between the extraction temperature and the extraction rate

由图1可见温度对淮山多糖萃取率的影响明显。在20～40℃范围内，随着温度的升高，淮山多糖萃取率不断提升，这可能是由于温度升高，加速了CO2流体的热运动，同时也提高了多糖分子热运动，加速了淮山多糖的溶出;在40～50℃范围内，淮山多糖萃取率随温度升高变化不大，这可能是由于淮山原料颗粒内外多糖转移达到平衡所致;萃取温度高于50℃时，萃取率随温度的升高而下降，这可能是在压力一定的情况下，超临界CO2流体密度随着温度升高而降低，溶剂化效应下降，淮山多糖在其中的溶解度降低导致萃取率下降;也可能是部分多糖在较高温度下被氧化、分解，导致多糖萃取率降低。

2.1.2 超临界CO2流体萃取压力对淮山多糖萃取率的影响

图2 萃取压力对淮山多糖萃取率的影响Fig.2 The relationship between the extraction pressure and the extraction rate

超临界CO2流体压力是影响淮山多糖萃取率的重要因素。由图2可以看出，在20～30MPa范围内，淮山多糖的萃取率随着压力的增大在不断升高，这可能是因为在温度一定的条件下下超临界CO2流体的密度随压力的升高而升高，淮山多糖的溶解度随之加大，多糖溶出增加导致的;淮山多糖的萃取率在30～40MPa范围内随超临界CO2流体压力的提高变化不大，这可能和萃取压力增加，超临界CO2流体密度增加，扩散性降低，淮山多糖传质速率降低量与压力升高导致的溶解度增大量达到平衡有关。同时萃取压力增大也会导致设备、操作费用的升高。

2.1.3 超临界CO2流体萃取时间对淮山多糖萃取率的影响

图3 萃取时间对淮山多糖萃取率的影响Fig.3 The relationship between the extraction time and the extraction rate

由图3可以看出萃取时间能够明显影响淮山多糖的萃取率。在1～2h时间范围内，淮山多糖的萃取率随萃取时间的延长而提高，这可能是因为淮山多糖在短时间内不能充分溶出，萃取时间延长，淮山多糖从原料颗粒中充分溶出导致的。在2～2.5h时间范围内，淮山多糖的溶出达到平衡，表现为萃取率随萃取时间的延长变化不大;在2.5～3h时间范围内，可能是因为有部分淮山多糖被氧化、分解，故表现为萃取率随萃取时间的延长而降低。

2.1.4 超临界CO2流体萃取夹带剂用量对淮山多糖萃取率的影响

图4 萃取夹带剂用量对淮山多糖萃取率的影响Fig.4 The relationship between the extraction cosolvent and the extraction rate

夹带剂用量能明显改变超临界CO2流体的萃取性能。由图4可知在夹带剂用量为0的情况下，由于超临界CO2流体的弱极性和淮山多糖的不挥发性，淮山多糖的萃取率较低;当夹带剂加入量在0～100mL范围内增加时，超临界CO2流体的极性改变，淮山多糖萃取率随之提高;夹带剂加入量在100～200mL范围内增加时，萃取率变化不大，这可能是超临界CO2流体的极性在此范围内变化不大，对淮山多糖的溶解性改变不大导致的。

图5 淮山样品粒度对淮山多糖萃取率的影响Fig.5 The relationship between the particle size and the extraction rate

2.1.5 淮山粒度对淮山多糖萃取率的影响

淮山样品粒度在10～50目范围内增加时，淮山多糖的萃取率随之增加，这可能是由于颗粒减小，超临界CO2流体能够进入颗粒内部进行充分交换的原因。当粒度在50～70目范围内增加时，淮山多糖萃取率变化不明显;当粒度在70～100目范围内增加时，淮山多糖的萃取率减少，这可能是较小的淮山颗粒堵塞萃取隔板小孔，使萃取产物不能及时转移到分离缸造成的;还可能是淮山颗粒较小，短时间内溶出大量的淮山多糖，部分多糖被氧化、分解，从而导致萃取率降低。在萃取过程中，淮山样品粒度较小时会发生结块现象，影响萃取效率。根据试验结果综合考虑，固定淮山样品粒度为40目。

2.2 正交试验

表2 正交试验结果Table2 Results of orthogonal experimental design

由表2中极差分析结果可知，超临界CO2流体萃取淮山多糖的各因素影响依次为萃取压力(B)＞萃取温度(A)＞夹带剂用量(D)＞萃取时间(C)。在试验设计参数范围内，优化得到的最佳萃取方案为B2A3D3C3，即萃取压力35MPa、温度45℃、90%乙醇作为夹带剂用量150 mL、时间2.5 h。

2.3 验证实验

按照正交试验得到的超临界CO2流体萃取淮山多糖的最佳工艺条件，即萃取压力35MPa、温度45℃、90%浓度乙醇作为夹带剂用量150 mL、时间2.5 h，萃取淮山多糖，平行做3次，淮山多糖平均值为0.32%，高于正交试验表中每一项试验结果，确定B2A3D3C3为最佳萃取方案。

3 结论

在单因素试验的基础上通过正交试验优选得出超临界CO2流体萃取淮山多糖的最佳工艺条件:萃取压力35MPa、温度45℃、90%浓度乙醇作为夹带剂用量150 mL、时间2.5 h，在此条件下淮山多糖萃取率高。