血竭生肌膏对糖尿病大鼠皮肤溃疡VEGF、PCNA表达的影响

张东萍，曹建春，鞠 上

糖尿病作为全球最主要的慢性疾病，对人类的健康和生活质量影响重大。糖尿病溃疡是糖尿病的严重并发症之一,病情复杂、治疗困难、易于复发,往往久治不愈,致残致死率高，医疗资源消耗大，给个人、家庭和社会带来了沉重的负担[1]。糖尿病患者创面难愈是由体内高糖环境和多种生物学因素共同作用导致的疾病。患者皮肤因局部微环境改变及免疫趋化应答功能障碍，局部生物因子的失调和生长因子水平减低，最终形成顽固性难愈创面[2]。

我们在临床中运用科内协定外用处方血竭生肌膏治疗糖尿病皮肤溃疡，临床疗效较理想。本研究通过大鼠腹腔链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）建立糖尿病大鼠模型，并在大鼠背部造成糖尿病皮肤溃疡模型，分别给予不同药物干预，应用免疫组化法，检测糖尿病大鼠皮肤溃疡组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）的表达水平，分析其与创面愈合的相关性。

1 材料与方法

1.1 动物及主要材料 雄性Wistar大鼠40只，体质量210～230 g，清洁级。购自北京维通利华实验动物技术有限公司。正常饲养1周后进行实验。（2）仪器：包埋机：KD-BM 生物组织包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司。切片机：LEICA2016，德国。图像采集：采用OLYMPUS BX–41荧光显微镜及NIKON DIGITAL SIGHT彩色CCD。数据分析软件：Image Pro Plus6.0，Media Cybernetics公司。（3）主要试剂：STZ：美国Sigma公司产品；50%冰乙酸：购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司。 兔抗VEGF抗体和小鼠抗PCNA抗体（博士德 BA0569）；Envision免疫组化染色试剂盒Histostain-Plus Mouse Primary（Cat.No.85-6643）、Histostain-Plus Rabbit Primary（Cat.No.85-6743）购自美国Invitrogen公司。血竭生肌膏由北京中医药大学东直门医院药学部提供，成份主要由蜈蚣、三七、蜂房、血竭各50 g组成，药物经研碎后与凡士林1:1混匀备用。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立[3]大鼠禁食12 h后，将STZ 150 mg溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH 4.4）10 mL中，配制成15 g/L的STZ溶液。按STZ 50 mg/kg 溶液一次性大鼠腹腔注射。正常对照组大鼠腹腔一次性注射等体积不含STZ的0.1mol/L、pH 4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后，以血糖＞16.65 mmol/L 为糖尿病大鼠模型成功。

1.3 糖尿病大鼠皮肤溃疡模型的建立[4]在糖尿病大鼠造模成功后1周，用10%水合氯醛麻醉，按0.33 mL/100 mg体质量注射于大鼠腹腔。麻醉成功后，在大鼠腰背部取2 cm×2 cm正方形区域，用脱毛剂脱毛后，切除皮肤至浅筋膜，形成缺损性创面，每日用50%冰醋酸涂创面1次，1周后形成缺损性皮肤溃疡大鼠模型。正常对照组大鼠不进行糖尿病造模，而仅在大鼠背部取2 cm×2 cm正方形区域，用脱毛剂脱毛后，切除皮肤至浅筋膜，形成缺损性创面，每日用50%冰醋酸涂创面1次，1周后形成缺损性皮肤溃疡大鼠模型。

1.4 动物分组及用药 40只大鼠按随机数字表法随机分为正常对照组、糖尿病模型组、中药治疗组和西药治疗组，每组10只。正常对照组大鼠创面外涂生理盐水；糖尿病模型组大鼠创面外涂生理盐水；中药治疗组予血竭生肌膏外涂，用棉签将血竭生肌膏均匀涂抹于动物创面上呈一薄层；西药治疗组外涂EGF（金因肽）。每日1次，共治疗4周。

1.5 创面组织中VEGF、PCNA的表达分析 实验4周后，处死大鼠，取创面组织经4%多聚甲醛0.01 mol/L（pH=7.4）固定液固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。Envision免疫组化染色方法检测创面组织中VEGF和PCNA的表达，按照试剂盒具体说明操作。采用HPIAS-100高清晰度彩色病理图像分析系统观察免疫组化结果。在染色均匀区选取5个高倍镜视野，计算光密度值。

1.6 统计学方法 采用SPSS11.0软件包进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（） 表示，多组比较采用F检验, 多组间两两比较采用q检验；P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠皮肤溃疡创面愈合情况 4周后，模型组溃疡未见明显缩小，脓性分泌物较多，肉芽组织不新鲜；中药治疗组创面趋于基本愈合，明显优于西药治疗组及模型组；正常对照组创面基本愈合。

2.2 创面组织中VEGF、PCNA的表达 糖尿病模型组大鼠溃疡创面VEGF、PCNA的表达明显低于西药治疗组、中药治疗组，差异极显著（P＜0.01），中药治疗组大鼠溃疡创面VEGF、PCNA的表达明显高于西药治疗组（P＜0.01）。见表1、图1、图2。

表1 血竭生肌膏对糖尿病大鼠溃疡创面VEGF、PCNA表达的影响（）

表1 血竭生肌膏对糖尿病大鼠溃疡创面VEGF、PCNA表达的影响（）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

组别 n VEGF PCNA对照组 10 0.15000±0.011832 0.15217±0.013819模型组 10 0.07367±0.010690a 0.08067±0.008262a西药组 10 0.07467±0.014264a、b 0.11583±0.010553a、b中药组 10 0.07567±0.006532a、b 0.12167±0.009668a、b

3 讨论

我国糖尿病患者基数占全球比例的第一位，文献调查研究显示[5]，我国糖尿病发病率在成人中约占11.6%，而高危人群可高至50%以上。糖尿病皮肤溃疡是糖尿病的严重并发症，治疗难度大，中医药能够多途径、多方位地干预糖尿病溃疡，从而取得较好疗效。

我们的协定外用处方血竭生肌膏，由血竭、露蜂房、蜈蚣、三七四味药组成。血竭，性味甘、咸、平，具有活血散瘀、定痛、止血生肌等功效，常用于疮疡不敛。《新修本草》：“主五脏邪气，带下，心痛，破积血，金疮生肉。”露蜂房，性味甘平，主治疮疡肿毒，瘰疬，顽癣瘙痒等。蜈蚣，性味辛温，治疗疮疡肿毒，瘰疬痰核。三七，性味甘、微苦，温，具有散瘀止血，消肿定痛等功效。四药合用，起到活血化瘀、祛腐生肌作用，促使创面愈合。

糖尿病患者皮肤易受损伤，且损伤后创面愈合延迟或不愈合。以前研究认为[6-8]，糖尿病合并创面难愈可能与以下因素有关。⑴糖代谢紊乱及晚期糖其化终末产物增多：后者可以干扰内皮细胞与白细胞间的相互作用，使单核巨噬细胞功能受抑制，并抑制内皮细胞增殖；⑵微血管改变：表现为广泛的小血管内皮增生及毛细血管基底膜增厚，引起血流量减少，局部出现缺血、缺氧；⑶基质金属蛋白酶（MMPs）在糖尿病患者致伤前后的表达异常：致伤初期，MMPs过少不利于清除伤口中的异物，而后期，MMPs过度表达，不利于胶原和其质形成；⑷表皮生长因子受体的改变：表皮生长因子受体激活后能促进有丝分裂或诱导细胞调亡，增加细胞活性，促进蛋白质分泌，诱导细胞分化或细胞去分化；⑸表皮细胞增殖障碍：在创伤愈合过程中，创面的再上皮化依赖于表皮细胞的增殖等生物学行为的正常发挥。由此可见，糖尿病创面难愈的机制很复杂，本实验通过观察大鼠糖尿病溃疡创面VEGF及PCNA的表达水平变化，研究中药血竭生肌膏的作用机理。

图1 VEGF 免疫组织化学方法（Envision×100）

图2 PCNA 免疫组织化学方法（Envision×100）

VEGF是一种肝素结合性双价糖蛋白，其基因位于染色体6p21.3，全长14kb。VEGF是内皮细胞的有丝分裂刺激因子和趋化因子，血管内皮细胞是VEGF的靶细胞，同时也是VEGF的重要来源。VEGF的主要生物学功能为：（1）促进有丝分裂和趋化作用（体外促进内皮细胞生长，在体内诱导血管生成。（2）提高微血管的通透性，导致体液和蛋白渗出，故又将其称为血管渗透因子。VEGF的表达与局部氧浓度、激素、细胞因子、生长因子等因素有关，且机体中许多细胞因子和生长因子通过调节VEGF的表达间接发挥促血管生成和抗血管生成作用。VEGF通过促进血管内皮细胞的增殖、促进内皮细胞的变形及移动，使其进入胶原，形成新生血管；促进微静脉、小静脉通透性增加，有利于蛋白质大分子外渗，部分外渗的蛋白质可形成纤维蛋白质，支持内皮细胞生长，从而促使创面愈合。VEGF对生理性血管生成和病理性血管再生都有重要的调节作用，具有促进血管再生，增加血管的通透性及保护神经元等多项功能。在伤口修复过程中，VEGF协同碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）刺激内皮细胞生长，促进伤口血管化的进程。有临床和动物实验资料表明[9-11]：糖尿病足患者患肢骨骼肌血管内皮生长因子基因表达水平明显低于非糖尿病下肢动脉粥样硬化闭塞症患者。糖尿病大鼠创面VEGF的表达在伤后各时相点显著低于正常对照组大鼠，且表达明显滞后。由于缺血肢体内VEGF基因表达减少，引起糖尿病足闭塞血管周围侧支血管明显减少，侧支代偿不足，缺血性溃疡持续进展且难以愈合，这可能是引起糖尿病足溃疡的重要原因[12]。本研究也证实了这一观点，糖尿病模型组大鼠溃疡创面VEGF的表达明显低于正常对照组，差异极显著（P＜0.01）。这与相关研究结果一致，即糖尿病足患者皮肤组织损伤后，局部VEGF水平下降，这也是糖尿病足皮肤损伤不易修复的重要原因之一。

本研究显示，糖尿病模型组大鼠溃疡创面VEGF的表达明显低于西药治疗组、中药治疗组，差异极显著（P＜0.01）。而中药治疗组大鼠溃疡创面VEGF的表达明显高于西药治疗组。所以，我们认为中药血竭生肌膏通过升高糖尿病大鼠溃疡创面VEGF的表达，促进新生血管形成和肉芽组织生长，改善局部营养状态，从而促进糖尿病溃疡创面的愈合，可能是中药膏促使糖尿病足溃疡愈合的机制之一。

PCNA是一种在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，能直接参与细胞增殖的DNA复制，其表达增高可促进细胞DNA合成增加，是目前能较好反映细胞增殖状况的指标之一[13-14]。PCNA是增殖细胞核内DNA聚合酶的一种辅助因子，与真核细胞S期的DNA的复制有关，是反映细胞增殖状态的一个重要指标[15-16]。创面组织中的PCNA主要定位于表皮基底层细胞、毛囊上皮细胞、内皮细胞和部分成纤维细胞的细胞核内，在皮肤组织的发生与修复过程中表达增强[17]。本实验结果显示糖尿病模型组大鼠溃疡创面PCNA的表达明显低于西药治疗组、中药治疗组，而中药治疗组大鼠溃疡创面PCNA的表达又明显高于西药治疗组，说明血竭生肌膏对创面组织细胞的增殖有明显的促进作用，能加快创面再上皮化，促进创面愈合，也可能是中药促使糖尿病足溃疡愈合的机制之一。