TRIB3基因和TLR4蛋白在糖尿病血管病变中的表达及桃仁干预作用

周 玉，刘国涛，卢增珍，徐 阳，王 军

糖尿病的危害主要是对于各脏器微血管和大血管的损害，并以此为基础造成的各种慢性并发症[1]。在周围血管病方面，糖尿病大血管病变是临床防治的重点。目前人们多认为，糖尿病病人高糖、高脂的代谢综合征是促使动脉粥样硬化的病理原因，动脉粥样硬化的病理学基础主要是脂质代谢障碍，因此研究重点主要集中在改善脂质代谢、降低血小板聚集等[2-3]。我们前期研究发现，糖尿病股动脉纤维化大鼠中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1)、 结 缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）以及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的表达增多，运用中药桃核承气汤，能够较为有效地抑制糖尿病大血管病变向纤维化方向发展[4-5]。本研究主要从假性蛋白激酶3（tribbles 3，TRIB3）基因，Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）蛋白角度探索其和糖尿病大鼠股动脉纤维化的相关性，为糖尿病大血管纤维化机制研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD大鼠200只，清洁级，2月龄，体质量（180±20） g。由天津实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK-（军）2012-0004。

1.2 主要试剂 TLR4一抗，购自武汉博士德；山羊抗兔IgG二抗抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；HRP标记二抗，Actin（5A7）mAb M20010内参抗体，购自天津赛尔生物有限公司；ECL液显色购自KPL公司；Trizol（Cat.No.15596026）购自Invitrogen公司；SYBR Green PCR混合液购自Life Technologies公司。

1.3 主要仪器 Epgiadients PCR仪（Eppendorf公 司 ）；ABI7500 Fast荧 光 定 量PCR仪（Life Technologies公司）；转膜仪（上海东玺制冷仪器设备有限公司）；灌胃针、吸管、EP管等由海门市春博生物实验器材厂提供。

1.4 造模及分组方法 雄性SD大鼠200只，采用简单随机数字表法随机选30只为对照组。余170只进行糖尿病大血管纤维化造模。造模分两步进行，首先进行糖尿病造模，然后进行糖尿病血管纤维化造模，方法参考文献[6-7]，即：高脂高糖饲料喂养4周诱导胰岛素抵抗。4周后，禁食不禁水12 h，称重。行腹腔注射STZ35 mg/kg。第3、7 d测血糖，血糖＞16.7 mmol/L者为糖尿病鼠造模成功。继续高脂高糖喂养，进行糖尿病血管纤维化造模。10周后，随机选取3只动物处死，对照组随机选取1只动物处死。分别剥取股动脉，福尔马林固定，光镜下观察糖尿病大血管纤维病变造模是否成功。糖尿病大血管纤维化造模成功后采用简单随机数字表法随机选取30只为模型组,30只为桃仁干预组。桃仁干预组予以桃仁颗粒剂水溶液10 mL·kg-1·d-1灌胃连续7周。模型组予生理盐水10 mL·kg-1·d-1灌胃，对照组不予处理。

1.5 取材 每组随机选取5只大鼠，用10%的水合氯醛麻醉。麻醉后根据股动脉搏动情况确定股动脉的位置和走行方向。将皮肤沿股动脉走向纵向切开，用纹式钳把周围组织钝性分离开来，暴露股动脉鞘。用眼科镊沿着血管走向钝性分离出股动脉约4～5 cm，两端剪断，PBS冲洗，平均分成两部分，一部分采用4%多聚甲醛进行固定，另一部分置于无菌冻存管中，-80 ℃冰箱保存。

1.6 观察指标

1.6.1 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测大鼠股动脉TRIB3基因表达 提取总RNA（Trizol法提取），反转录，反应体系为25 μL，12.5 μL SYBR Mix，1 μL cDNA，上下游引物各1 μL，ddH2O体积9.5 μL，合计25 μL。仪器为ABI Step-plus 系统。GAPDH作为内参。TRIB3上游引物为：TGCTCTTTGGCAAGATCCGT，下游引物：AGACTTGGCTGCAATCCTCC， 长 度 165 bp；GAPDH内参上游：TGTGAACGGATTTGGCCGTA，下游：GATGGTGATGGGTTTCCCGT，长度208 bp。

1.6.2 TLR4免疫组化检测 采用SP法，按照试剂盒说明书进行。依次对切片进行脱蜡、梯度酒精水化、抗原修复、血清封闭、一抗孵育、二抗标记、DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、干燥、封片等主要步骤。

1.6.3 Western bloting检测TLR4表达 液氮低温研磨组织，Modified RIPA Buffer充分裂解，超声波破碎组织。4 ℃下12000 g离心15 min，取上清经BCA蛋白定量法对各样本的蛋白浓度进行定量。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，配制分离胶为10%的SDS-PAGE凝胶。取32 μL总蛋白、8 μL的5×Loading Buffer，煮沸3 min，立即冰置3 min，上样。100 V电压电泳转膜。转膜结束后取出杂交膜进行封闭。用25 mLTBS洗膜5 min，置膜于25 mL 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。15 mL TBS-T洗3次。加入一抗，β-actin，4℃过夜，缓慢摇动。加入辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗（1：10000），室温孵育1 h，缓慢摇动。二抗孵育完毕后，按照ECL发光液试剂盒说明书均匀滴加显色液，放入凝胶成像仪中显影。蛋白条带用Image Lab软件分析。比较各组蛋白条带灰度值的大小。

1.9 统计学方法 采用SPASS20.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（）表示，先采用Shapiro-Wilk检验判断数据是否为正态分布，所有数据均呈正态分布且方差齐性，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2 型糖尿病大鼠造模结果 2型糖尿病大鼠造模过程中死亡7只，另外9只血糖平均值为10.6 mmol/L，未达到大鼠实验性糖尿病标准，剔除实验。其余154只大鼠2型糖尿病制模成功，逐渐表现出多饮、多食、多尿的特点。血糖值在16.7～32.7 mmol/L之间，平均23.7 mmol/L。死亡率为4.1%，成模率为90.6%。

2.2 2 型糖尿病大鼠大血管纤维病变造模结果 光镜下观察，对照组大鼠股动脉血管平滑肌细胞排列规则，血管腔大小形态正常。模型组出现平滑肌细胞排列紊乱，内皮细胞肿胀，内膜、中膜层明显增厚，血管腔狭窄，并见大量泡沫细胞，纤维帽，弹力纤维断裂，胶原纤维玻璃样变，甚至出现胆固醇结晶，钙盐沉着等。证实2型糖尿病大血管纤维病变造模成功。造模过程中，死亡19只。造模过程中死亡率15.3 %，成模率79.4%。

2.3 大鼠股动脉TRIB3表达 RT-qPCR结果显示，桃仁干预组与模型组比较有显著统计学差异（P＜0.01），与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）；模型组与对照组比较有显著统计学差异（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠股动脉TRIB3的RT-qPCR表达的比较（）

表1 各组大鼠股动脉TRIB3的RT-qPCR表达的比较（）

注：与对照组相比，aP＜0.05，aaP＜0.01；与模型组相比，bP＜0.01

组别 n TRIB3桃仁干预组 5 1.3638±0.0948a、b模型组 5 2.3241±0.0654aa对照组 5 1.0000±0.0000

2.4 TLR4免疫组化染色 分析三组鼠股动脉中TLR4免疫组织化学染色，结果显示，免疫组织化学染色阳性区域表现为黄色物质。桃仁干预组及对照组大鼠血管内皮细胞及中膜平滑肌细胞中有散在黄色物质，呈弱阳性改变；模型组可见大量棕黄色物质表达呈强阳性反应。（见图1-图3）。

2.5 大鼠股动脉TLR4表达 桃仁干预组与对照组比较，TLR4表达增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，TLR4表达明显减低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。模型组与对照组比较，TLR4表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2、图 4。

表2 各组大鼠股动脉TLR4蛋白表达的比较

图1 对照组

图2 模型组

图3 桃仁干预组

图4 三组TLR-4蛋白条带

3 讨论

糖尿病大血管病变是糖尿病严重的并发症，糖脂代谢的紊乱使得病变的病理表现常常是动脉粥样硬化。因此，研究的重点主要是干预大血管粥样硬化的发生、发展，降低糖尿病大血管病变的发生。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，包含多种细胞因子、巨噬细胞、T淋巴细胞和内皮细胞的相互作用[8],还有血管平滑肌细胞和成纤维细胞大量增殖所致的动脉中膜、外膜不规则增厚、纤维化和钙化[9-10]。课题组在前期研究中发现，糖尿病大血管病变和血管纤维化密切相关，初步发现了一些和纤维化相关的因子，如TGF-β1、CTGF。这些致纤维化的因子沉积在大血管中，使血管管腔不断的产生胶原蛋白I、胶原蛋白Ⅲ等，最终使血管管腔狭窄、闭塞。

本研究发现，糖尿病大血管纤维化模型大鼠股动脉中TRIB3表达较对照组明显升高（P＜0.01）。说明TRIB3基因和糖尿病大鼠大血管纤维化有着密切联系，可能是作为致纤维化过程中的一个环节。TRIBs是近年来新发现的一类丝氨酸苏氨酸蛋白激酶样蛋白基因家族[11]，TRIB3是基因家族成员之一，目前TRIB3基因被认为是与糖尿病血管病变的相关基因之一。有研究表明，TRIB3基因沉默能够逆转心肌间质纤维化的进程[12]。TRIB3基因调控纤维化是否存在于血管中、是否调控糖尿病大血管纤维化进程是我们研究的目标。免疫组化检测TLR4表达显示，对照组糖尿病大鼠股动脉血管内皮细胞及中膜平滑肌细胞中有散在黄色物质，模型组则存在大量棕黄色物质。提示TLR4在糖尿病大鼠纤维化模型中高度表达。Western bloting检测大鼠股动脉TLR4表达得到了一致性的验证。现研究中，TLR4作为Toll样受体通路中的一员，在组织纤维化中的作用性研究逐渐深入[13-14]，是研究纤维化进程中的重要蛋白。本研究在糖尿病大鼠纤维化模型股动脉中也得到了初步验证。由此可见，TRIB3基因、TLR4蛋白和大鼠动脉纤维化之间存在密切关系，根据实验结果分析，可以推测糖尿病大鼠股动脉纤维化进程中，高糖、慢性炎症刺激引起内毒素增多，TRIB3、TLR4蛋白表达上调，进一步激活致纤维化的信号传导通路，导致股动脉纤维化的产生。

目前，在血管纤维化机制研究方面，多数研究着眼于寻找致胶原蛋白产生、细胞外基质沉积从而使血管纤维化的细胞因子和因素。如，粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、表皮生长因子、IL-6、IL-1α、干扰素-γ、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板源生长因子(PDGF)、M-CSF、MCP-1、TNF-α、aFGF以及碱性成纤维细胞生长因子等。这些因子产生于内皮细胞、单核细胞、平滑肌细胞等能够对动脉粥样硬化产生影响作用的细胞中。这些因子会刺激细胞,促进细胞的增殖和转化，进而对平滑肌的迁移和基质的沉积产生刺激作用。本研究在前期也进行了促进细胞外基质沉积、促纤维化的研究，并发现如TGF-β、CTGF等细胞因子。

在发现上述TRIB3基因、TLR4蛋白表达在糖尿病大鼠大血管纤维化上调的基础上，采用中药桃仁干预可以在一定程度上降低其表达，说明桃仁可以阻断TRIB3基因、TLR4蛋白表达，进而阻断纤维化进程。桃仁是临床上活血化瘀剂中的常用药物，也是治疗组织纤维化的常用药物。有研究显示桃仁可以降低纤维连接蛋白、α-平滑肌激动蛋白的表达来减缓肾间质纤维化[15]，桃仁提取物可通过促进Ⅰ型、Ⅲ型胶原的降解和吸收,发挥抗肝纤维化的作用,能有效提高肝纤维化的治疗效果[16]。在糖尿病血管病变中，血瘀病机往往存在，运用桃仁等活血化瘀常能有效缓解症状，减缓疾病进展。

本研究从分子水平证实了桃仁在抑制纤维化相关基因通路的作用，但具体机制还需要深入研究。