巴尔喀什黑伞3种胞外纤维素酶活力变化规律研究

黄春霖 林辰壹 刘玉 李萨

摘 要：巴尔喀什黑伞是新疆独有的珍稀野生食药用真菌，为了解其对纤维素的降解特性，试验以羧甲基纤维素为培养基内的固定碳源，测定巴尔喀什黑伞在液体培养条件下菌丝体生长过程中羧甲基纤维素酶、滤纸酶、β-葡萄糖苷酶活力，探讨其胞外纤维素酶活力变化规律。结果显示，巴尔喀什黑伞纯菌丝体培养过程中，羧甲基纤维素酶活力峰值出现在第3 天，为0.406 U·mL-1，滤纸酶活力峰值出现在第2天，为0.238 U·mL-1，二者变化规律均表现出峰值后波动降低的趋势;β-葡萄糖苷酶活力变化近“S”型，峰值出现在第12天，为1.233 U·mL-1，该酶活力峰值出现时间较滤纸酶和羧甲基纤维素酶明显滞后。

关键词：巴尔喀什黑伞;碳源;羧甲基纤维素;纖维素酶

中图分类号：TQ920.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.11.015

Study on the Change Regularity of Extracellular Enzyme Activity of Agaricus balchaschensis

HUANG Chunlin1， LIN Chenyi1， LIU Yu2， LI Sa1

（1. College of Forestry and Horticulture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi，Xinjiang 830052， China; 2. Agricultural Technology Promotion Center in Midong District in Urumqi， Urumqi， Xinjiang 831400， China ）

Abstract： The Agaricusbalchaschensis is a unique and rare wild edible medicinal fungus in Xinjiang. In order to understand its degradation to cellulose， carboxymethyl cellulose（CMC） was used as a fixed carbon source in the culture medium to determine the activities of carboxymethyl cellulase， filter paper enzymes（FP） and β-glucosidase（BG） of A. balchaschensis. The results showed that during the cultivation of the pure mycelium of A. balchaschensis， the peak of CMC activity appeared on the third day， which was 0.406 U·mL-1， and the peak of enzyme activity of FP appeared on the second day， which was 0.238 U·mL-1， both of the two enzymatic activity above showed a tendency to decrease after the peak. The BG activity had a tendency nearly "S" type， and the peak appeared on the 12th day， which was 1.233 U·mL-1， the peak appearance time was significantly delayed compared to FP and CMC activity.

Key words： Agaricus balchaschensis;carbon source;carboxymethyl cellulose;cellulase

新疆地大物博，享有得天独厚的自然环境优势，随着农业产业化结构的调整升级，加之新疆独有的野生食用菌资源丰富，对于新疆农业可持续性发展以及食用菌的生产存在着诸多的发展潜力和机遇。巴尔喀什黑伞（Agaricus balchaschensis Samgina & G.A.Nam）隶属于蘑菇科蘑菇属[1]，是国内独有的且仅分布于新疆博斯腾湖和巴里坤湖等内陆湖泊沿岸，极具营养价值的珍稀野生食用菌[2]。巴尔喀什黑伞菌柄与菌盖中富含钙、镁、铁等矿质元素，含量均显著高于双孢蘑菇、香菇、金针菇及平菇，并且子实体中还包含12种脂肪酸，其中，亚油酸和棕榈酸含量所占比例较大[3]，是集食药用价值于一身的天然保健食品。

与食用菌生长密切相关的胞外酶共有6种，研究比较成熟的有纤维素酶、半纤维素酶、木质素分解酶、果胶酶、蛋白酶和淀粉酶[4]。研究认为，大多数食用菌在生长过程中对培养基内营养物质的利用与胞外酶活力变化规律是相关的，例如双孢蘑菇在菌丝体生长时期，胞外淀粉酶活力与木质素的降解速率呈现正相关性，在子实体生长时期羧甲基纤维素酶（endo-1，4-β-D-glucanase， 简称CMC酶）和滤纸酶（Filter paper cellulose， 简称FP酶）与纤维素降解的速率呈现正相关性，子实体生物量与羧甲基纤维素酶活力高低存在正相关性[5-6]。同样，在姬松茸的相关研究指出，姬松茸胞外CMC酶、FP酶呈周期性变化，活力高峰对应子实体成熟期[7]。纤维素酶属于水解纤维系，其主要成分内切葡聚糖酶（CMC酶）、外切葡聚糖酶（exo-1，4-β-D-glucanase， 简称CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-1，4- glucosidase， 简称BG酶）协同作用，经过3个水解步骤将纤维素转化葡萄糖，并且这3个水解过程同时发生[8]。

本试验通过研究巴尔喀什黑伞在纯菌丝体培养条件下其胞外纤维素酶活力变化规律，进一步分析纤维素大分子营养物质的降解利用特性，旨在为提高巴尔喀什黑伞生物学效率以及充分挖掘其内在利用潜力提供依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试菌种采用新疆农业大学园艺实验室经组织分离低温保藏的巴尔喀什黑伞菌株，编号为XJAU-Ab2016。

1.2 方 法

1.2.1 发酵液制备 采用曹春蕾等[9]的方法进行。将PDA加富培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂加富培养基）中葡萄糖替换为等量的羧甲基纤维素20 g，并去除培养基中的琼脂制成液体培养基[10]。将制备好的液体培養基分装至250 mL三角瓶，每瓶注入培养液150 mL，其中各处理设置3次重复。每150 mL液体培养基接种直径为5 mm菌丝圆片3片。静置12 h后于25 ℃恒温，150 r·min-1摇床振荡培养，培养周期14 d。

1.2.2 待测酶液的制备 从振荡培养开始每天同一时间均匀取发酵培养液10 mL，采用快速定量滤纸过滤后，将混合培养液分装至5 mL离心管，4 000 r·min-1离心10 min，获得上清液即为待测的粗酶液[11]。

（1）CMC酶活力的测定。 参照边银丙[12]的方法进行。向25 mL的具塞刻度试管内加入0.52%的羧甲基纤维素溶液（pH值4.8，0.1 mol·L-1的柠檬酸缓冲液配制）1.5 mL，在50 ℃水浴条件下预热3 min后，加入待测酶液0.5 mL混匀，50 ℃水浴保温30 min，取出后立即加入DNS（3，5二硝基水杨酸）试剂 3.0 mL，以煮沸灭活的酶液作对照，每个处理3次重复。摇匀后迅速置入沸水中，加热10 min，流水冷却至室温后加蒸馏水定容至25 mL，充分混匀测540 nm处吸光值。将不同浓度的葡萄糖溶液设置6个梯度，其中每毫升标准液中所含葡萄糖量为1 mg，分别取标准液0.1～0.6 mL用蒸馏水逐一补足至2 mL与DNS试剂反应共热，测540 nm处的吸光值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。

（2）BG酶活力的测定。 依据孙骊珠等[13]的方法并稍作调整。向25 mL具塞刻度试管中加入0.5%的水杨苷（购自Sigma公司）溶液（pH值4.8，0.1 mol·L-1的柠檬酸缓冲液配制）1.5 mL，后续操作程序同CMC酶活力测定方法。

（3）FP酶活力的测定。 参照边银丙[12]的方法进行。取干燥平衡24 h后的定性滤纸，剪裁成宽度1 cm，质量为（50±0.5） mg的滤纸条，将滤纸条折叠成“M”状，置入25 mL具塞刻度试管底部;之后缓慢加入0.1 mol·L-1的柠檬酸缓冲液（pH值4.8）1.5 mL，使滤纸完全浸没于缓冲液中;在50 ℃水浴条件下预热3 min后，分别加入待测酶液0.5 mL，置于50 ℃水浴中保温60 min，其余步骤同CMC酶测定。

每分钟内转化1 μmol底物或转化1 μmol相关基团所需的酶量为1个酶活力单位（U·mL-1）。

酶活力=■ ×1 000×V （1）

式中，m是根据标准曲线方程计算出OD值对应的葡萄糖含量（μg）;M为葡萄糖的摩尔质量（g·mol-1）;0.5为反应时所需的酶液体积（mL）;t为水浴反应的时间（min）;1 000为转化子（1 mmol=1 000 μmol）;V表示所取粗酶液总体积（mL）。

1.3 数据处理

试验所得数据采用Microsoft Excel 2010整理，使用SPSS 21.0通过One-way ANOVA及Duncan法对纤维素酶活力在不同培养时间内进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 巴尔喀什黑伞CMC酶活力变化规律

巴尔喀什黑伞在14 d的培养周期内均可检测出CMC酶活力（图1），CMC酶活力随培养时间的延长表现出先降低后增加至峰值，然后逐渐降低并保持相对稳定，其峰值出现在培养周期内的第3 天，为0.406 U·mL-1，显著高于其他培养时间（P <0.05），较14 d培养周期内CMC活力均值0.265 U·mL-1高出53.2%，是活力最小值（第14天）的1.8倍;继峰值出现后的第4～14天，CMC酶活力均显著低于1～3 d（P <0.05），整体呈波动下降趋势。

2.2 巴尔喀什黑伞BG酶活力变化规律

由图2可知，随培养时间延长，巴尔喀什黑伞BG酶活力先升高至峰值后略有下降，整体变化规律近“S”型，其峰值出现在第12天，为1.233 U·mL-1，较培养周期内该酶活力均值0.823 7 U·mL-1高出49.69%，是最小值（第2 天）的5.0倍。BG酶活力在培养周期的第1～3天差异不显著，在第4～9 天显著增加（P<0.05），第10天显著下降（P<0.05）至第8 d的活力水平。第11天和第12天差异不显著（P>0.05），活力均显著高于其他各培养时间（P<0.05）。第13天和第14天显著下降（P<0.05）至第9天的活力水平。

2.3 巴尔喀什黑伞FP酶活力变化规律

由图3可知，随培养时间延长，巴尔喀什黑伞FP酶活力呈现先增大后波动降低的趋势，后期保持相对平稳的水平。FP酶活力峰值出现在培养周期内的第2天，为0.238 U·mL-1，显著高于其他培养时间（P <0.05），较培养周期内FP酶活力均值0.231 U·mL-1高出3.0%，是最小值（第8、14天）的1.7倍。培养周期的第3天和第6天 FP酶活力值显著低于第2天（P<0.05），显著高于第1天、第4天、第8天、第10～14天（P<0.05）。

3 结论与讨论

巴尔喀什黑伞在以羧甲基纤维素为碳源的条件下，均可检测出CMC酶、BG酶和FP酶的活力。在巴尔喀什黑伞菌丝体生长期间，CMC酶活力峰值出现后开始下降并趋于稳定。在双孢蘑菇中，菌丝体生长时期CMC酶活力在其整个生长发育阶段处于最低水平，但随着培养时间的不断增加，菌丝体CMC酶活力缓慢增加[14]，这与本研究的结果有所差异，说明巴尔喀什黑伞对纤维素代谢能力有其自身的特性。由于纤维素酶属于诱导酶系[15]，不同底物所构成的培养基对CMC酶活力具有诱导作用[16]，因此，要提高巴尔喀什黑伞纤维素代谢水平以及产纤维素酶的能力，可能需在培养基质中添加相应的诱导物质。BG酶在菌丝体生长期间表现出递增的趋势，随培养时间的延长持续增大并趋于稳定，变化规律呈近“S”型。BG酶活力峰值出现的时间为第12天，相对于FP酶及CMC酶活力峰值具有明显的滞后性，这也验证了CMC酶在降解纤维素的同时，多种胞外纤维素酶协同作用，最终由BG酶水解纤维二糖转换为单糖，逐步积累供菌丝体利用的作用机理[17]。

FP酶在培养周期内同样表现出达到峰值后活力下降，整体保持相对平稳的变化趋势，这与梁志英等[18]对姬松茸的相关研究中发现菌丝体生长时期FP酶活力变化保持相对平稳的趋势结论一致，该研究还指出姬松茸对纤维素的降解能力低于木质素，而本文对于巴尔喀什黑伞利用木质素的能力是否优于纤维素还有待进一步的探究。由于滤纸可以表现出与纤维素聚合度及结晶度一致的条件，故可用FP酶表征纤维素酶的总糖化能力[19]，通过巴尔喀什黑伞FP酶活力变化规律可知，其总糖化能力在培养周期内保持相对稳定的水平。

胞外纤维素酶的分泌对巴尔喀什黑伞营养利用具有重要的影响，同时对菌丝体生长也存在着制约或促进的作用。因此，对巴尔喀什黑伞胞外纤维素酶活力的探讨能够进一步了解其对多糖类碳源利用的特性，可为巴尔喀什黑伞资源的开发以及生理生化研究奠定基础。

参考文献：

[1]张金霞. 中国食用菌菌种学[M]. 北京： 中国农业出版社， 2011： 39.

[2]赵振宇. 新疆食用菌志[M]. 乌鲁木齐： 新疆科技卫生出版社， 2001： 70-71.

[3]杨琴， 杜双田， 张桂香. 博湖蘑菇矿物质、脂肪酸成分分析[J]. 食品科学， 2013， 34（6）： 231-233.

[4]顾雅君， 王瑛， 刘建荣， 等. 与食用菌相关主要酶的研究和应用[J]. 中国食用菌， 2006， 25（1）： 40-42.

[5]陈庆榆， 史钧， 何华奇， 等. 双孢蘑菇几种胞外酶的活性测定[J]. 安徽科技学院学报， 2011， 25（6）： 35-38.

[6]SMITH J F， CLAYDON N， LOVE M E， et al. Effect of substrate depth on extracellular endocellulase and laccase production of Agaricus bisporus.[J]. Mycological research， 2011， 93（3）： 292-296.

[7]倪新江， 丁立孝， 潘迎捷， 等. 姬松茸在兩种培养基上生长期间九种胞外酶活性变化[J]. 菌物系统， 2001， 20（2）： 222-227.

[8]TOMME P， WARREN R A J， GILKES N R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi[J]. Advances in microbial physiology， 1995， 37： 1-81.

[9]曹春蕾， 崔宝凯， 秦问敏. 桑木层孔菌液体培养过程中几种胞外酶活性的变化[J]. 菌物学报， 2011， 30（2）： 275-280.

[10]肖兴， 陈春兰， 陈清乐， 等. 培养基和温度对巨大口蘑菌丝生长的影响[J]. 江苏农业科学， 2009， 37（4）：215-216.

[11]曾东方， 杨帆， 聂欢欢. DNS法对食用菌发酵液淀粉酶活力的测定[J]. 现代农业科技， 2011（11）： 16.

[12]边银丙. 食用菌栽培学[M]. 北京： 高等教育出版社， 2017： 298-300.

[13]孙骊珠， 罗兰， 袁忠林. 马缨丹提取物对黄胸散白蚁体内酶活性的影响[J]. 林业科学， 2017， 53（5）： 107-115.

[14]林新坚， 江秀红， 林戎斌， 等. 姬松茸菌株的胞外酶活性及与产量的关系[J]. 食用菌学报， 2007， 14（3）： 28-32.

[15]高染染， 刘倩， 孙文良， 等. 粗糙脉孢菌蛋白表达系统构建研究[J]. 生物技术通报， 2016， 32（7）： 160-169.

[16]李辉， 王义强， 陈介南， 等. 里氏木霉产纤维素酶的诱导和合成机理研究进展[J]. 中国酿造， 2011， 30（6）： 8-12.

[17]张丹. 纤维素酶的研究进展及其展望[J]. 青海畜牧兽医杂志， 2017， 47（3）： 49-52.

[18]梁志英， 孟俊龙， 刘靖宇， 等. 姬松茸碳源利用规律的研究[J]. 山西农业大学学报（自然科学版）， 2007， 27（1）： 79-81.

[19]黄慰情. 高温纤维素降解菌的筛选、鉴定及产酶条件研究[D]. 杭州： 浙江大学， 2014.