一起多血清型副溶血性弧菌聚集性腹泻事件的病原分析*

施怡茹，陈洪友，卢晓芸，赵锦江，高红梅，马 英，徐秋芳△

(1.上海市青浦区疾病预防控制中心 201700；2.上海市疾病预防控制中心 200336)

副溶血性弧菌(Vp)主要分布于近海海水、海河交界处、海产品和腌制产品中，是夏、秋季沿海地区引起腹泻性疾病的主要食源性病原菌，其主要致病因子为耐热直接溶血素(TDH)和耐热直接溶血素相关溶血素(TRH)，携带有TDH或(和)TRH的菌株被称为产毒株[1-3]。2016年8月上海市某区发生一起聚集性腹泻事件,在某宾馆就餐的人员中，陆续有29人出现恶心、腹痛和腹泻等不适症状，均前往医院就诊并采取肛拭样品。经流行病学调查，该29例患者均在27日于该宾馆就餐，膳食由宾馆食堂烧制，发病前5 d内均无其他集体性聚餐活动。28日03:00出现首发病例，最后1例出现于29日04:00。患者主要症状为不同程度的恶心、呕吐、水样便腹泻、上腹或脐周痛(绞痛或阵发痛)，个别病例伴有头晕、头痛。相关工作人员现场采集可疑样品，送往实验室进行分离检测和溯源分析。

1 资料与方法

1.1一般资料 29例患者肛拭样品、6份留存食品样品、6份餐具样品和5份餐厅从业人员肛拭样品，均严格无菌采样，并于2 h内送检。

1.2主要仪器 德国艾本德Reaiper4(Eppendorf)聚合酶链反应(PCR)仪；美国Bio-Rad CHEF Mapper脉冲场凝胶电泳仪；美国Applied Maths公司BioNumerics7.1分析软件；美国伯乐Bio-Rad GEL DocTMXR凝胶成像仪；法国生物梅里埃公司(BIOMERIEUX)VITEK_2_Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统。

1.3主要试剂 Vitek 2 GN生化鉴定板条[法国生物梅里埃公司(BIOMERIEUX)]；Proteinase K、XbaⅠ、NotⅠ限制性内切酶(Takara生物工程有限公司)；SeaKem Gold Agarose(美国Cambraex Bio Rockland公司)；Gelred染色液(美国BIOTIUM公司)；副溶血性弧菌血清(Denka Seiken，日本)；革兰阴性需氧菌药敏试验检测板(上海星佰生物技术有限公司)；Premix ExTaq Version20、DL2000TM DNA Maeker(Takara生物工程有限公司)。所有增菌液和培养基均由上海华康科技公司和上海科马嘉科技公司提供。所有试剂均在有效期内使用。

1.4方法

1.4.1菌株分离及鉴定 肛拭样品按照《感染性腹泻的诊断标准》WS271-2007进行分离检测，食品样品按照GB 4789.7-2013、GB 4789.10-2010、GB 4789.4-2010、GB 4789.5-2013、GB/T4789.6-2003等标准要求进行检测，经全自动微生物生化鉴定确证。

1.4.2菌株血清分型 用Vp 11种O抗原(O1～O11)及65种K抗原(K1、K3～K13、K15、K17～K26、K28～K34、K36～K61、K63～K71)进行血清分型[4]。

1.4.3PCR检测TRH、TDH、toxRS-new、toxRS-old和orf8-up基因 热裂解法提取VpDNA，PCR检测目的基因，引物序列参考文献[2,5]，见表1。各引物分别进行PCR，反应体系为：PREmix TaqTM(TaKaRa Code：RR901A)为12.5 μL，DNA模板为1.5 μL，按表1所示的引物终浓度加入相应体积的各种引物，加无菌蒸馏水补足总体积为25.0 μL；PCR循环反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 60 s，52 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，循环25次，各PCR反应体系的退火温度见表1[4]。最后取5.0 μL产物置于1%琼脂糖凝胶电泳中电泳30 min。

表1 引物名称、序列及预期产物大小

1.4.4药敏试验 选取氨苄西林、庆大霉素、四环素、阿奇霉素、氯霉素、复方磺胺甲噁唑、环丙沙星、萘啶酸、头孢唑啉、阿莫西林/克拉维酸、头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛等17种抗生素，选用肉汤稀释法测定最小抑菌浓度，按照药敏试验检测板试剂盒说明书进行具体操作和结果判断。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，由上海市疾病预防控制中心提供。

1.4.5PFGE分子分型 参考美国疾病预防控制中心PulseNet USA的方法。作为相对分子质量标准的参考菌株为H9812，由上海市疾病预防控制中心提供，用XbaⅠ酶切；Vp用NotⅠ酶切；图谱用BioNumerics7.1软件分析。

2 结 果

2.1病原学检测结果

2.1.1分离培养结果 从20例患者肛拭样品和1例餐厅从业人员肛拭样品中分离出疑似Vp，其在弧菌显色平板上为圆形、扁平、湿润、不透明、紫色的大菌落。未检出其他致病菌(金黄色葡萄球菌、沙门菌、志贺菌、致泻性大肠杆菌)。

2.1.2菌体形态与生化结果 经革兰染色镜检，该21株可疑菌均为革兰阴性无芽孢杆菌，在3%氯化钠三糖铁斜面上均为斜面红色、底层黄色、不产气、硫化氢阴性。经Vitek 2 GN生化鉴定板条确证，该21株可疑菌均为Vp，生化结果见表2。

2.2血清分型结果 该21株Vp可分为4种血清型别，分别为O3:K6型15株，占71.43%，O4:K8型4株，占19.05%，另有2株K抗原不可分型的菌株，即O3:KUT和O4:KUT 各1株，KUT为O和(或)K不可分型者，见表3。

2.3tdh、trh、toxRS-new、toxRS-old、orf8-up基因检测 结果显示，所有菌株均不含毒力基因trh；仅1株血清型O3:KUT的菌株tdh基因为阴性，其余菌株tdh基因均为阳性，携带率为95.24%。血清型O3:K6菌株均为toxRS-new、orf8-up阳性，toxRS-old阴性；其余血清型别的菌株该3种基因携带情况与O3:K6相反，见表3。

表2 21株疑似菌株生化鉴定结果

注：+为阳性，-为阴性

表3 毒力基因、血清分型结果

续表3 毒力基因、血清分型结果

注：+为阳性，-为阴性

2.4药敏试验结果 见表4。21株Vp药敏试验结果基本一致，氨苄西林和头孢唑啉耐药率为100.00%，复方磺胺甲噁唑耐药率为95.24%，萘啶酸耐药率为19.05%，头孢西丁耐药率为9.52%，四环素耐药率为4.76%，其余11种抗生素敏感率均为100.00%。

表4 21株Vp药敏试验结果[n(%)]

2.5PFGE分型结果 21株Vp的PFGE图谱采用Bio Numerics7.1软件进行聚类分析，以Dice系数计算相似度，UPGMA法建树，差异<4的菌株可归为同一聚类。分析结果显示，基因组DNA片段得到较好的分离。按照100%相似度可分为7种带型，不同血清型别的菌株互为不同的带型，且同源性较低，见图1。血清型O3:K6有3种带型：VP16001、VP16002、VP16003，其之间的同源性分别为96.30%和81.70%，其中VP16003为主要优势型别，有9株，占42.86%，VP16001次之，有4株，占19.05%；血清型为O4:K8有两种带型：VP16004和VP16005，其之间的同源性为90.0%；相同血清型的不同PFGE带型之间条带差异均<4。

图1 Vp PFGE聚类分析图

3 讨 论

Vp主要引起人体以发热、呕吐、腹泻等症状为主的急性肠胃炎，其引发的食源性发病案例分布世界各地[6-7]。全国突发公共卫生事件的网络数据显示，在总体食物中毒原因中，Vp位居第2[4]；在上海地区导致食源性疾病的发病率为76.5人次/10万[8-9]。

本次聚集性腹泻事件分离得到21株Vp，从患者肛拭样品中检出的20株Vp均携带tdh基因，不携带trh基因，分离自餐厅从业人员的1株Vp不含毒力基因tdh和trh，即为不产毒株，不具备传染、侵袭他人的毒力。

MATSUMOTO等[10]利用toxRS基因序列建立了toxRS-new用于检测O3:K6，以区分大流行菌株与非流行菌株。toxRS-new阳性菌株可判为大流行菌株，具有致病性强、tdh阳性、trh阴性等特点，其中超过96%的菌株携带f237噬菌体的orf8片段[11]。O3:K6是上海地区腹泻人源性Vp的优势血清型[1]。O3:K6也是环太平洋地区、欧洲地区大流行菌株的优势血清型[4-5]。此次聚集性腹泻事件Vp的优势血清型别为O3:K6，与上海地区一致；毒力基因携带情况符合大流行菌株特点；其余3种血清型别(O4:K8、O3:KUT、O4:KUT)是O3:K6关系相近的血清型变种[5]。

根据学者提出的有关菌株同源性的判断标准及同源性≥85%的菌株可被认为是来源同一克隆株的理论，该起事件检出的21株Vp中，相同血清型的不同PFGE带型之间存在1～3个条带差异，具有高度同源性，为同一聚类，可能来自同一污染源。

药敏试验结果显示，21株Vp的抗生素耐药情况基本一致，与文献[12-13]报道基本一致，对氨苄西林和头孢唑啉的耐药率最高，达100.00%，对头孢他啶、四环素、阿莫西林/克拉维酸等均敏感。近年来，滥用抗生素及细菌之间耐药基因传递等原因使细菌耐药情况愈发严重，进而受到广大医务人员的重视[13-14]。因此，需密切关注Vp的耐药情况及变化，以期有效指导临床合理使用抗生素。

综上所述，此次聚集性腹泻事件是由O3:K6和O4:K8两种血清型为主的5种不同克隆株Vp混合感染引起的。而分离自餐厅从业人员的菌株为非产毒株，与分离自患者的Vp，可视为无相关性。因此，引起此次事件的病原菌来源尚未确定，不排除由于此次送检的可疑样品不全，未采集到致病菌污染样品。建议相关部门在处理此类事件时，应扩大可疑食物或相关环节样品的采样范围。此次事件可怀疑为该宾馆食堂用具被多种血清型Vp污染，或是食品在烹煮过程中存在尚未熟透的现象，或是食堂厨房存在用具生熟未严格分开、食品储存保管不当等，均是造成Vp迅速繁殖、多重污染并引起聚集性腹泻事件的可能原因。