乌骨藤提取物通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制黑色素瘤细胞的活力并诱导细胞凋亡*

贺新伟， 郭贵龙， 陈积贤， 吴伟力

(瑞安市人民医院， 浙江 瑞安 325200)

黑色素瘤是最常见的皮肤肿瘤之一[1]。虽然中国是黑色素瘤的低发区，但其发病率却呈逐年上升的趋势[2]。黑色素瘤具有药物抵抗和高转移率的特性，因此患者预后往往较差[3-4]。虽然目前针对黑色素瘤的治疗有一定进展，特别是在靶向治疗和免疫治疗方面，但转移性黑色素瘤的预后仍不容乐观[5]。因此，寻找新的潜力治疗药物尤为重要。乌骨藤(RadixFissistigmaeglaucescentis)是我国传统药物，具有较强的抗炎活性，常被用于治疗关节炎、气管炎、膀胱炎、扁桃体炎及肺炎等疾病[6]。现代研究表明，乌骨藤提取物(Marsdeniatenacissimaextract，MTE)还具有抗肿瘤活性，能抑制食道癌、胃癌、肺癌和肝癌等多种肿瘤细胞增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡[7-10]。同时，MTE还能降低肿瘤对化疗药物的抵抗性[11-12]。但其对黑色素瘤的作用及作用机制还未见报道。本研究将以小鼠皮肤黑色素瘤细胞系B16-F10为研究对象，探究MTE对黑色素瘤细胞活力及凋亡的作用及作用机制。

材 料 和 方 法

1 药物、试剂与仪器

MTE由西安润泽生物技术有限公司提供(货号为20101),用DMSO助溶，用细胞培养液配制浓度为5 mg/L的MTE溶液，临用前稀释，且DMSO终浓度不超过0.1%。

DMEM-H培养液和胎牛血清购自Gibco；胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)购自Abcam；抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9抗体均购自Cell Signaling Technology(货号分别为2586、9662和9508)；抗Ki67抗体购自Abcam(货号为ab16667)；HRP标记山羊抗小鼠和HRP标记山羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术有限公司。

HBS-1096A酶标仪购自南京德铁实验仪器公司；流式细胞仪购自Thermo Fisher；电泳仪和半干转膜仪均购自Bio-Rad。

2 方法

2.1细胞培养 黑色素瘤细胞系B16-F10购自ATCC，货号为ATCC® CRL-6475TM。用含有10%胎牛血清的DMEM-H培养液进行培养，培养条件为37 ℃、5% CO2。

2.2MTT法检测细胞存活率 将细胞传代培养于96孔板中,并随机分为 0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L MTE组，每组加入相应浓度的MTE处理24 h或分别处理0 h、24 h、48 h、72 h和96 h，每孔加入20 μL MTT溶液于37 ℃孵育4 h后，加入150 μL DMSO，混匀后用酶标仪于570 nm处检测细胞吸光度(A)值。

2.3流式细胞术检测细胞凋亡 将细胞用不同浓度MTE处理72 h后，用PBS清洗3次，加入0.25%胰蛋白酶收集各组细胞，配制成1×109/L的细胞悬液，每个Falcon试管中加入100 μL细胞悬液，并加入5 μL Annexin V-FTTC和5 μL PI，避光孵育15 min后，加入结合缓冲液，1 h后用流式细胞术检测细胞凋亡情况，以Q2区细胞比例为细胞凋亡率。

2.4Western blot检测蛋白表达 用不同浓度MTE处理细胞或将细胞分为B16-F10组、MTE(200 mg/L)组、IGF-1(22 μg/L)组和MTE+IGF-1组，分别加入相应浓度的MTE或(和)IGF-1处理后，加入RIPA裂解液提取细胞蛋白。用BCA试剂盒检测各组蛋白浓度并调平。10% SDS-PAGE分离蛋白并转移蛋白至PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜2 h后，加入适宜浓度 I 抗(Ki67, 1∶1 000; PCNA, 1∶800; cleaved caspase-3, 1∶1 000; cleaved caspase-9, 1∶1 000; Bax, 1∶1 200; Bcl-2, 1∶1 000)4 ℃封闭过夜。第2天弃去 I 抗，用TBST洗膜3次，加入相应 II 抗，室温孵育 1 h后，TBST洗涤3次，滴加ECL显色液曝光显影。

3 统计学分析

用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析和秩和检验。实验结果均以均数±标准差(mean±SD)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MTE对黑色素瘤细胞活力的影响

与0 mg/L组比较，MTE作用24 h后，50 mg/L组、100 mg/L组和200 mg/L组细胞活力的变化差异均无统计学显著性，见图1A；MTE作用72 h和96 h后，100 mg/L组和200 mg/L组的细胞活力显著降低(P<0.05)，见图1B。同时，50 mg/L组、100 mg/L组和200 mg/L组细胞增殖蛋白Ki67的蛋白表达水平较0 mg/L组比较明显降低(P<0.05)，100 mg/L组和200 mg/L组细胞的PCNA表达水平显著低于0 mg/L组(P<0.05)，见图3。这些结果表明高浓度MTE能抑制黑色素瘤细胞生长。

2 MTE对黑色素瘤细胞凋亡的影响

流式细胞术结果表明，与0 mg/L组比较，100 mg/L组和200 mg/L组黑色素瘤细胞的凋亡率明显升高(P<0.01),见图2；细胞凋亡相关蛋白cleaved caspas-3和cleaved caspase-9的蛋白水平也显著增多(P<0.05或P<0.01)，见图3。这些结果提示MTE能诱导B16-F10细胞凋亡。

3 MTE对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

为了研究MTE抑制B16-F10细胞活力、诱导细胞凋亡的机制，我们检测了MTE处理细胞后，PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况。与0 mg/L组比较，50 mg/L组细胞的p-PI3K/PI3K和

Figure 1.The effect of MTE on the viability of melanoma cells. A: the effects of MTE at different doses on the viability of B16-F10 cells after treatment for 24 h; B: the effects of MTE at different doses on the viability of B16-F10 cells after treatment for 0, 24, 48, 72 and 96 h. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs 0 mg/L group.

Figure 2.The effect of MTE on the apoptosis of melanoma cells. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs 0 mg/L group.

p-AKT/AKT的比值明显降低 (P<0.01)；100 mg/L组和200 mg/L组的mTOR蛋白明显减少，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值明显降低(P<0.01)，表明MTE能抑制黑色素瘤细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，见图4。

4 激活PI3K/AKT/mTOR信号通路对MTE抑制细胞活力、诱导细胞凋亡作用的影响

为了进一步证明MTE抑制黑色素瘤细胞活力、诱导细胞凋亡作用与其抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活有关，我们采用IGF-1激活PI3K/AKT/mTOR通路，并检测细胞增殖和凋亡相关蛋白水平的变化。实验结果表明，IGF-1能显著诱导p-PI3K蛋白水平的升高(P<0.05)，表明其可激活PI3K/AKT/mTOR信号通路；同时与B16-F10组比较，IGF-1

Figure 3.The effects of MTE on the protein levels of proliferation-related and apoptosis-related proteins in the melanoma cells. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 mg/L group.

能明显促进黑色素瘤细胞Ki67、PCNA和Bcl-2的表达，抑制Bax的表达(P<0.05)，此外，IGF-1还能显著减弱MTE (200 mg/L)抑制B16-F10细胞Ki67、PCNA和Bcl-2表达和促进Bax表达的作用 (P<0.05)，与MTE(200 mg/L)组比较差异有统计学意义，见图5。

讨 论

乌骨藤是我国传统中药，中医认为其具有祛风湿、活血和止血的功效。现代研究表明其具有抗肿瘤活性，并且其制剂消癌平已经应用于临床晚期乳腺癌、胃癌、肺癌及大肠癌等的辅助治疗[13-15]。研究表明，乌骨藤抑制肿瘤的发生发展与其免疫调节作用有关，并且其还可通过抑制血管新生减缓癌症的发展[14-16]。同时，MTE还可抑制淋巴癌细胞增殖，诱导肺癌细胞凋亡从而抑制肿瘤生长[17-18]。在本研究中，我们用不同浓度MTE处理细胞发现，MTE处理细胞72 h和96 h时能显著抑制黑色素瘤细胞B16-F10的活性，同时还能抑制细胞增殖相关蛋白Ki67和PCNA的表达，表明MTE具有抑制黑色素瘤细胞生长的作用。

Figure 4.The effects of MTE on the protein levels of PI3K/AKT/mTOR pathway-related proteins. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs 0 mg/L group.

细胞凋亡抑制是肿瘤发展的重要机制之一，有效促进肿瘤细胞凋亡可抑制肿瘤的发生和发展[19]。Ye等[8]研究发现，MTE可通过诱导肿瘤细胞周期阻滞促进肿瘤细胞凋亡，从而减缓肿瘤发展。本研究实验结果表明，MTE可显著促进黑色素瘤细胞凋亡，并能诱导凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白水平，提示MTE在抑制黑色素瘤细胞活力的同时还可诱导癌细胞凋亡，从而减缓黑色素瘤的发展。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是调控细胞增殖和凋亡的经典通路之一[20]。PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活可以通过调控生长因子的表达抑制多类细胞凋亡[21-22]。抑制PI3K活性可显著抑制黑色素瘤细胞增殖[23]。研究表明，RAP抑制剂索拉菲尼可通过靶向调控PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞凋亡从而影响黑色素瘤的发展[24]。褪黑色素诱导黑色素瘤凋亡也与其抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活有关[25]。miR-425也可通过调控PI3K/AKT通路抑制黑色素瘤细胞增殖和迁移，同时诱导癌细胞凋亡[26]。本研究发现，MTE能显著抑制p-PI3K、p-AKT和mTOR的蛋白水平，表明MTE可抑制通路蛋白活化，从而抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，提示MTE抑制黑色素瘤细胞发展、诱导细胞凋亡的作用可能与其抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活有关。此外，用激活剂IGF-1激活PI3K/AKT/mTOR信号通路后发现，黑色素瘤细胞Ki67和PCNA表达水平明显升高，表明激活PI3K/AKT/mTOR信号通路可显著减弱MTE抑制黑色素瘤细胞生长的作用。同时，IGF-1还能明显减弱MTE诱导细胞凋亡作用，进一步表明，MTE抑制黑色素瘤细胞生长、诱导细胞凋亡与其调控PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

Figure 5.The role of activation of PI3K/AKT/mTOR pathway in the effects of MTE on the expression of proliferation- and apoptosis-related proteins. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs B16-F10 group; #P<0.05 vs MTE (200 mg/L) group.

综上所述，MTE能够抑制黑色素瘤细胞生长，并诱导黑色素瘤细胞凋亡，从而减缓黑色素瘤的发展，并且其机制与调控PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。本研究对MTE对黑色素瘤的作用及作用机制进行了初步探讨，为MTE用于黑色素瘤的治疗提供实验数据的支撑。