轮作与连作对烟田土壤微生物区系及多样性的影响

张笑宇,段宏群，王闷灵，李红丽，芦阿虔，王 岩

(1.郑州大学化工与能源学院，河南 郑州 450001；2.河南省洛阳市烟草公司，河南 洛阳 471000)

烟草是一种易产生连作障碍的农业作物，随着栽培年限的延长，连作障碍愈来愈显著，长期烤烟连作对烟叶的产量和质量都会产生很大影响[1-2]。轮作不仅是土壤耕作管理的重要措施，而且属于生态防治土传病害的范畴。在烤烟生产上，合理轮作既可以减轻土传病害，又可以达到增产提质的目的。

土壤中存在的大量微生物对于土壤营养元素循环、植物的生长发育和作物病虫害防治等方面均起着极其重要的作用，同时土壤生物学性状可以反映土壤质量和肥力特征，是评价土壤健康的重要生物学指标[3]，土壤微生物群落对土传病害的抑制能力是土壤生态系统平衡、健康和稳定的另一个重要指标[4-5]。以往对于烟草不同种植模式的研究主要关注土壤养分、烟草农艺性状等变化[6-8]，对于根际土壤微生物区系的研究较少，同时对土壤微生物的研究大多采用传统平板涂布分析方法，此方法仅能分离出不到1%的土壤微生物，而现代分子生物学技术为不可培养微生物分析提供了有利的手段，具有检测限低、灵敏度高等优势。因此，论文采用高通量测序技术，研究连作和轮作对烟田根际土壤微生物群落结构、分布特征等的影响，明确烟田根际土壤微生物群落的变化规律，为利用生物技术提高烟田土壤健康的措施提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 烟田概况与材料

在充分调研的基础上，2016年在洛阳市洛宁县罗岭乡讲理村和上戈镇上坡村，选取长期轮作的烟田(玉米-烟草)Ro和连续种烟5年的烟田CC5。该烟区的主要土传病害是黑胫病、根腐病和根结线虫病，并且这3种病害易并发，因此，本研究过程在对烟田土传病害进行调研时，将这3种病害进行合并统计。洛宁烟区4～9月平均温度21.75℃，合计降水量425.56 mm，日照时间1 699.16 h，平均相对湿度75.31%，试验田概况和土壤基本性状如表1和表2所示。分别于移栽前、旺长期和成熟期采样，按蛇型5点取样法，取0～20 cm根际土壤，采用四分法将土壤混匀并编号[9]，将土样带回实验室处理：部分风干过筛用于土壤理化性状测定，部分置于4℃冰箱保存，用于检测实验室可培养微生物数量；部分装离心管-20℃冷冻保存，委托生工生物工程(上海)股份有限公司对土壤微生物多样性进行测定和分析。

表1 试验田概况

表2 烟田土壤理化性状

1.2 试验方法

1.2.1 土壤理化性质测定方法

用常规方法测定土壤pH值和含水率；用重铬酸钾-油浴法测定土壤有机质；用硫酸消解-凯氏定氮法测定土壤全氮；用乙酸铵提取-火焰光度法测定土壤速效钾；用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法测定土壤有效磷；用碱解扩散法测定土壤碱解氮[10]。

1.2.2 可培养微生物数量的测定

土壤可培养微生物数量采用稀释平板法[11]:细菌用牛肉膏蛋白胨培养基；真菌用孟加拉红培养基；放线菌用高氏1号培养基。

1.2.3 微生物多样性分析测定

土壤样品送生工生物工程(上海)股份有限公司进行高通量多样性测序分析。土壤样本经过预处理后，利用试剂盒提取DNA。对提取到的DNA利用琼脂糖电泳检测，检查DNA的完整度，利用检测试剂盒精确定量基因组DNA，确定PCR反应加入的DNA量。以全部基因组DNA为模板，细菌16S rDNA引物分别为341F和805R；真菌18S rDNA引物分别为NS1和Fung，进行PCR扩增，采用琼脂糖回收试剂盒对DNA进行回收。

OTU数表示烟田根际土壤中检测到的物种数量。香浓指数衡量群落之间的差异性， Chao1指数是计算得到的土壤微生物物种总数[8]。

在本试验分析中，属水平和门水平群落结构分布图只显示了物种丰度占比的前10位。

聚类树状图通过树枝结构直观地反应多个样本间的相似度和差异关系。

1.2.4 烟株发病情况调查

在烟株成熟期，按照GB/T 23222—2008烟草病虫害分级及调查方法调查各小区烟株(每个小区调查100株)的病害发生情况。

1.2.5 数据处理

试验数据均采用Excel 2013和SPSS 21软件进行统计分析。多样性基因测序由公司相应软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 轮作和连作烟田根际土壤可培养微生物数量的变化

在烟株生长的过程中，轮作和连作烟田根际土壤可培养微生物数量结果如表3所示。由表3可知，烟田根际土壤中细菌、放线菌和真菌数量移栽前均较少，旺长期明显增多，且放线菌的增幅远高于细菌和真菌，到成熟期可培养微生物数量又有不同程度的下降。这主要是由于旺长期温度适宜，烟株根系生长旺盛,根系分泌物增加，从而导致可培养微生物数量显著增长[12]；成熟期烟株根系活力下降,根系分泌物减少，甚至分泌一些有毒物质[13-14]，不利于微生物的生长，导致成熟期微生物数量下降。从表3还可知，在烟株生长过程中，轮作烟田根际土壤可培养细菌和放线菌的数量均高于连作烟田，且在旺长期细菌呈现显著性差异。细菌是土壤中优势微生物，在土壤环境中对物质和能量的转化起主要作用，放线菌则可改善土壤团粒结构，代谢产物中含有生长激素，且放线菌产生的抗生素能抑制病原菌，控制病虫害发生[15]。因此，轮作烟田根际土壤中细菌和放线菌数量的提高对抑制土传病害具有重要的意义。该轮作和连作烟田之间可培养细菌和放线菌的变化趋势与李鑫等[16]的研究一致。轮作烟田根际土壤中可培养真菌在移栽前高于连作烟田，但未达到显著性差异，到旺长期和成熟期则低于连作烟田，说明连作烟田根际土壤的微生物群落结构从细菌型逐渐向真菌型转化，与张仕祥等[17]研究结果相同。

表3 烟田根际土壤中可培养微生物数量 (104cfu/g干土)

注：不同的小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。

2.2 不同烟田根际土壤微生物Alpha多样性分析

Alpha多样性也称为生境内物种多样性，关注均匀生境下的物种数目[18]。利用Alpha多样性分析中的OTU数、香浓指数和Chao1指数分析烟田根际土壤中微生物的多样性。轮作烟田和连作烟田根际土壤微生物Alpha多样性的结果如表4所示。

表4 烟田根际土壤微生物Alpha多样性分析

由表4可知，在烟株生长过程中，轮作烟田根际土壤细菌的OTU数、香浓指数和Chao1指数均高于连作烟田。轮作烟田在移栽前真菌群落OTU数、香浓指数和Chao1指数均高于连作烟田；旺长期轮作烟田真菌群落OTU数高于连作烟田，香浓指数和Chao1指数则低于连作烟田；成熟期轮作烟田真菌群落OTU数、香浓指数高于连作烟田，而Chao1指数低于连作烟田。对Alpha多样性分析可知，相较于烟草连作，轮作能够提高微生物群落多样性，与之前贾志红等[19]的研究一致。

2.3 不同烟田根际土壤微生物群落结构相似度分析

聚类树状图反应多个样本间的相似度和差异性，轮作和连作烟田根际土壤微生物在属水平上的群落聚类树状图如图1所示。

图1不同烟田根际土壤微生物群落在属水平上的聚类树状图

从图1a可以看出，移栽前轮作和连作烟田根际土壤细菌群落结构比较相似，旺长期和成熟期不同土壤之间细菌群落结构则存在较大的差异性。随着烟株生长，轮作和连作烟田根际土壤细菌群落结构趋于相似，而与移栽前差异较大。图1b真菌群落结构相似度的变化趋势与细菌一致。

2.4 不同烟田根际土壤微生物群落结构分布规律

微生物在门水平上不同种植模式烟田根际土壤细菌群落结构分布如图2。轮作和连作烟田根际土壤优势菌门是Proteobacteria(变形菌门)，相对丰度在30.98%～54.84%，其次为Acidobacteria(酸杆菌门)相对丰度在10.35%～23.24%、Actinobacteria(放线菌门)相对丰度4.52%～10.51%。轮作烟田中Proteobacteria相对丰度在烟株生长过程中的变化趋势与可培养细菌数量变化趋势一致，呈现先增加后减少的趋势，旺长期达到最高。

根据多样性测序结果可知，移栽前轮作烟田与连作烟田根际土壤微生物在属水平上分别检测出细菌543类和429类，旺长期分别为421类和350类，成熟期分别为359类和369类。

不同种植模式烟田根际土壤细菌群落结构分布如图3所示，烟株生长发育的3个时期中Gp6、Gemmatimonas(芽单胞菌属)、Sphingomonas(鞘脂单胞菌属)和Pseudomonas(假单胞菌属)、Citrobacter(柠檬酸细菌属)均为优势菌属。轮作和连作烟田上述6种优势细菌属在移栽前的相对丰度分别占19.66%和21.85%，旺长期分别占30.95%和26.53%，成熟期分别占33.55%和26.01%，表明轮作和连作根际土壤优势细菌在属水平上的差异较小，但在旺长期和成熟期土壤优势菌属的相对丰度要高于移栽前。

图2 不同种植模式烟田根际土壤细菌在门水平上的群落结构分布图

图3 不同种植模式烟田根际土壤细菌在属水平上的群落结构分布图

从图3中还可知，在旺长期轮作烟田根际土壤中相对丰度为14.22%的Citrobacter，远远高于连作烟田(相对丰度为3.01%)。有文献表明Citrobacter作为益生菌能够抑制番茄青枯病的发生[20]。因此，推断Citrobacter对烟草土传病害的发生也存在一定的抑制作用。Sphingomonas是土壤主要有益菌之一，可促进烟株根际吸收营养，抵抗多种病原菌，还有研究表明，鞘脂单胞菌属中某些菌株具有固氮和脱氢特性，在维持土壤氮平衡方面起着重要作用[21]。轮作烟田根际土壤中Sphingomonas的相对丰度随着烟株生长逐渐增加，并且高于连作烟田。旺长期和成熟期轮作烟田根际土壤中Pseudomonas(假单胞菌属)丰度也高于连作烟田，Pseudomonas可抑制烟草黑胫病病原菌[22]，Serratia(沙雷氏菌属)作为有益菌属[23]也只存在于轮作烟田土壤中。

两种不同种植模式烟田根际土壤真菌在门水平上的群落结构分布如图4所示。烟田根际土壤优势菌门有Ascomycota(子囊菌门)，相对丰度为15.40%～77.80%，其次是Basidiomycota(担子菌门)，相对丰度为6.53%～33.28%，Cercozoa(丝足虫类)相对丰度为1.85%～45.06%。移栽前烟田根际土壤中Ascomycota相对丰度远高于旺长期和成熟期，这也解释了真菌群落聚类树状图移栽前与旺长期和成熟期真菌群落结构差异性较大的原因。另外，轮作烟田旺长期和成熟期根际土壤中Ascomycota和Basidiomycota的相对丰度均高于连作烟田。

图4 同种植模式烟田根际土壤真菌在门水平上的群落结构分布图

根据多样性测序结果，移栽前轮作烟田与连作烟田根际土壤真菌在属水平上分别检测出250类和246类，旺长期分别为226类和199类，成熟期分别为235类和209类。

不同种植模式烟田根际土壤真菌在属水平上的群落结构分布如图5所示，移栽前轮作和连作烟田根际土壤的优势真菌属是Penidiella、Gibberella、Setomelanomma、Protostelium，总相对丰度分别占54.88%和64.25%。旺长期轮作烟田根际土壤优势真菌属是Conocybe、Cryptococcu、Aspergillus、Penidiella、Gibberella、Pleospora，相对丰度占52.78%，连作烟田优势真菌属为Rhogostoma、Pythium、Spizellomyces、Cystofilobasidium、Setomelanomma、Amb-18S-1092、Sterigmatomyces、Vermamoeba，相对丰度共占69.43%。成熟期轮作烟田根际土壤优势真菌属为Conocybe、Penicillium、Turbinellus、Penidiella、Thielavia、Microascus、Brachyconidiellopsis，相对丰度共占40.39%，连作烟田优势真菌属为Amb-18S-1092、Zoophagus、Sterigmatomyces、Vermamoeba、Pythium、Pseudogymnoascus、Absidia、Cystofilobasidium、Thielavia，相对丰度共占62.64%。由此可见，烟株移栽前轮作和连作烟田之间优势真菌属的种类和相对丰度差异较小，但进入旺长期和成熟期后优势真菌属则出现较大差异。

从图5中还可以看出，轮作烟田根际土壤中有益菌Conocybe[24-25]在旺长期和成熟期的相对丰度分别为19.09%、14.28%，远高于连作烟田，有研究表明，对青枯病病原菌有拮抗效果的真菌属Aspergillus在旺长期相对丰度也高于连作烟田[26]。而Pythium作为根腐病的病原菌所在属[27-28]，只存在于连作烟田中。

图5 不同种植模式烟田根际土壤真菌在属水平上的群落结构分布图

3 结论与讨论

本文测定分析了玉米-烟草轮作烟田与烟草连作烟田根际土壤微生物数量和结构的变化规律。结果表明，在烟株生长过程中，实验室可培养细菌、放线菌和真菌数量均呈现出先增加后减少的趋势，并在旺长期达到最大。轮作烟田根际土壤可培养细菌和放线菌数量高于连作烟田。轮作烟田根际土壤可培养真菌的数量低于连作烟田，表明烟草连作导致了土壤微生物结构从细菌型向真菌型的转化。利用分子生物学方法研究轮作与连作烟田根际土壤微生物群落结构变化，结果表明，轮作烟田根际土壤细菌和真菌群落多样性均高于连作烟田，烟草连作使得土壤微生物的群落趋向单一化。通过对微生物聚类树状图分析发现，轮作和连作烟田在旺长期和成熟期微生物群落结构差异较大，进一步对微生物群落结构组成分析发现，轮作烟田根际土壤中有益细菌如Citrobacter、Sphingomonas、Pseudomonas、Serratia等相对丰度均高于连作烟田。旺长期和成熟期轮作烟田真菌在门水平上Ascomycota和Basidiomycota相对丰度高于连作烟田，在属水平上Conocybe(锥盖伞属)、Aspergillus(曲霉属)等拮抗菌相对丰度也高于连作烟田，而在连作烟田根际土壤中出现Pythium(腐霉属)病原菌属，该菌属在轮作烟田中并未出现。