不同直径化橘红果实中柚皮苷含量的比较

李琼霞 黎晓欣 谢承恩 廖辉

[摘要]目的 利用高效液相色谱法比较不同直径的化橘红果实之间的柚皮苷含量差异。方法 采集25批不同直径大小的化橘红果实粉碎过三号筛，加甲醇超声提取柚皮苷。采用Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇-6%醋酸水（35：65），流速1.0 ml/min，柱温25℃，检测波长283 nm，进样20 μl进行检测。结果 测定方法标准曲线为y=16.8568x+3.2460（r=0.9999），在0～80 μg/ml浓度范围内线性关系良好；最低定量浓度为6.67 μg/ml（信噪比为10：1）；3个浓度水平的平均加样回收率为99.66%，RSD为1.2%；重复性、精密度、稳定性等均符合要求。测得柚皮苷含量为3.26%～28.56%。结论 不同直径的化橘红果实之间柚皮苷含量差异显著，化橘红以幼果作为药用资源值得推广。

[关键词]不同直径；化橘红果实；柚皮苷含量

[中图分类号] R282.710.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）9（c）-0038-04

Comparison of naringin content in Exocarpium Citri Grandis fruits at different diameters

LI Qiong-xia1 LI Xiao-xin1 XIE Cheng-en1 LIAO Hui2

1. Department of Clinical Laboratory， Yuexiu Center for Disease Control and Prevention in Guangzhou City， Guangdong Province， Guangzhou 510055， China； 2. Department of Quality， Foshan Ziyunxuan Pharmaceutical Co. Ltd.， Guangdong Province， Foshan 528000， China

[Abstract] Objective To compare the difference in naringin content between fruits of Exocarpium Citri Grandis at different diameters using high performance liquid chromatography （HPLC）. Methods A total of 25 batches of Exocarpium Citri Grandis fruits at different diameters were crushed through No.3 sieve， and naringin was extracted by ultrasonic extraction with methanol. The column of Gemini C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used， the mobile phase was methanol and 6% acetic acid water with the ratio of 35：65， the flow rate was 1.0 ml/min， the column temperature was 25°C. The detection wavelength was 283 nm， and sample injection in 20 μl was for detection. Results The standard curve of the determination method was y=16.8568x+3.2460 （r=0.9999）， and the linearity was good in the range of 0-80 μg/ml. The lowest quantitative concentration was 6.67 μg/ml （signal to noise ratio was 10：1）. The average recovery rate of three concentrations was 99.66%， and the RSD was 1.2%. The repeatability， precision， and stability all met the requirements. The naringin content was between 3.26% and 28.56%. Conclusion There is a significant difference in the content of naringin in Exocarpium Citri Grandis fruits at different diameters， which is worth promoting young fruit of Exocarpium Citri Grandis as a medicinal resource.

[Key words] Different diameter； Exocarpium Citri Grandis fruit； Naringin content

近年來随着化橘红药材的广泛应用，市售化橘红药材形态各异，或以果实或以果皮或以饮片形态出售[1-2]。市面上对化橘红药材果皮和果实的药效性尚存在认识不充足[3-4]。现行药典收载的化橘红药材是化州柚或柚的未成熟或近成熟的干燥外果皮，化橘红果实并未作为有效部分收录在《中国药典》[5]。目前已有研究表明化州柚不仅仅是其外果皮，其果实也含有丰富的药效成分[3-4]。有研究发现其含有丰富的黄酮类、多糖类、挥发油等成分[2-3，6-8]，其主要有效成分黄酮类以柚皮苷等形式存在[9-10]，柚皮苷占黄酮类物质的主要比例[9-11]。柚皮苷是二氢黄酮类化合物，具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤和改善微循环抗过敏等功能[12-14]。在《中国药典》[5]中，柚皮苷一直作为检测化橘红质量的主要手段，本研究采集了不同果龄、不同直径的化橘红果实，对其主要药效成分柚皮苷进行研究比较，旨在深入研究化橘红果实，加深对该药材的认识，阐明不同直径的化橘红果实与主要有效成分柚皮苷含量之间的关系，为推广化橘红药材资源的合理应用提供研究数据，现报道如下。

1仪器与材料

1.1仪器

Agilengt1260高效液相色谱仪（安捷伦公司）；HN1006超声波清洗器（华南超声设备厂）；MILLIPORE超纯水机（密理博公司）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯公司）。

1.2材料

柚皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110722-201613，含量94.3%）；甲醇（纯度≥99.5%）。

1.3样品

不同直径化橘红果实均购自广东化州地区，经广州市药品检验所中药室候慧婵主任中药师鉴定，其为芸香科植物化州柚的果实。其中样品编号A1～A5来源于化州宝山区，A6～A10来源于化州平定镇大岭村，B1～B5来源于化州平定镇瀚堂，B6～B10来源于化州平定镇旺垌村，C1～C5来源于化州地区药店。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇（A）-6%醋酸水（B）=35：65，等度洗脱，流速1 ml/min，柱温25℃，进样量20 μl，检测波长283 nm。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品储备液 精密称取柚皮苷对照品8.50 mg，置100 ml容量瓶中，加70%甲醇适量使其溶解，并加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为柚皮苷储备液（每毫升含柚皮苷约80 μg）。

2.2.2样品溶液的制备 取样品粉碎，过三号筛，精密称取样品细粉约1 g置于50 ml离心管中，加40 ml甲醇，超声处理60 min，放冷，加甲醇稀释定容至50 ml，摇匀滤过，精密吸取续滤液0.5～25 ml比色管中，加70%的甲醇定容至刻度。

2.3系统适用性考察

取对照品溶液、样品溶液各20 μl进样，依法测定，结果提示，样品溶液色谱中柚皮苷峰与其他峰的分离度良好，理论塔板数为6943，拖尾因子1.0，未出现干扰峰，方法专属性良好（图1、2）。

2.4线性关系考察

精密吸取“2.2.1项”下的柚皮苷储备液，分别置于10 ml容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，制备成0、8、16、24、32、40、80 μg/ml的标准系列溶液，注入色谱仪，记录相应的峰面积，以柚皮苷浓度（x）和峰面积（y）进行线性回归，得方程为：y=16.8568x+3.2460，相关系数r=0.9998，提示柚皮苷在0～80 μg/ml的浓度范围内线性关系良好。

2.5检测限和定量限考察

取柚皮苷浓度为8 μg/ml的对照品溶液，定量稀释成系列溶液，依法测定，观察柚皮苷出峰情况，得最低检测浓度（信噪比3∶1）为2.00 μg/ml，最低定量浓度（信噪比为10∶1）为6.67 μg/ml。

2.6精密度试验

取“2.2.1项”下的柚皮苷对照品溶液1份，依法连续进样6次，计算柚皮苷色谱峰面积，其RSD为0.3%，提示仪器进样精密度良好。

2.7稳定性试验

取“2.2.2项”下的1份样品溶液分别于0、6、12、18、24 h进样测定，计算柚皮苷含量，其RSD为1.3%，提示样品溶液在24 h内稳定。

2.8重复性试验

取6份同一编号的样品，每份约1 g，按照“2.2.2项”下的样品溶液制备方法平行制备样品，结果柚皮苷含量平均值为4.85%，RSD为2.0%，提示方法重复性良好。

2.9加样回收率试验

取2份已知含量的供试样品，每份样品称3份，每份约1.0 g，分别进行高、中、低浓度加样回收率考察，按照“2.2.2项”下方法制备样品溶液，并进行测定，测得平均加标回收率为99.66%，RSD为1.2%（表1），符合方法学要求。

2.10样品中柚皮苷含量的测定

取25批化橘红样品，按照“2.2.2项”下方法制备样品溶液，依法进行测定，按标准曲线法计算柚皮苷含量，测得样品中柚皮苷含量最低为3.26%，最高为28.56%（表2）。

2.11统计学分析结果

采用统计学软件SPSS 19.0，对化橘红果实中的柚皮苷含量与果实直径大小进行直线回归性分析，得出相关系数为r=-0.765，线性方程为y=-1.618x+19.171，R2=0.584；进行Pearson相关分析，以α=0.01为水准，得出r=-0.765，P=0.000。柚皮苷含量（x）与果实平均直径（y）的散点图见图3。

3讨论

3.1样品提取条件的选择

化橘红中柚皮苷为二氢黄酮类化合物，分子结构中具有大量酚羟基，易溶于水、甲醇、乙醇等[12，15]。柚皮苷的提取有超声波提取法、加热回流提取法等[12，15-16]。本研究比较了两种提取方法，提取效率相差不大，但超声法更为方便简捷。本研究采用甲醇超声提取，对提取时间进行单因素试验，结果提示，提取1 h效果较好。

3.2高效液相色谱条件的选择

在高效液相色谱测定条件的选择中，考虑到柚皮苷为有机酸类分子[12]，流动相中加入6%乙酸，抑制有机酸的解离，增加其在固定相中的分离。实验室常用流动相中有机相一般为甲醇、乙腈，本研究考察了甲醇-乙酸水，乙腈-乙酸水溶液流动相体系，结果提示，以甲醇-乙酸水（35∶65）作流动相时，柚皮苷与其他峰的分离度较好。文献报道柚皮苷在紫外线283 nm波长下吸收最大[17-18]，本研究结果也提示，在波长283 nm处色谱图柚皮苷峰清晰，其他杂质峰较少。

3.3样品含量结果分析

统计软件SPSS 19.0直线相关性分析结果提示，相关系数r=-0.765，P=0.000。按α=0.01的水准，认为果实中柚皮苷含量与果实直径成负相关。化橘红果实柚皮苷含量与直径大小成反比，果龄越长果实直径越大，柚皮苷含量越低；当果实直径从12.5 cm减小到2.0 cm时，其含量从4.36%提高到28.56%。《中国药典》2015年版一部中规定，化橘红饮片中柚皮苷含量不得低于3.5%。本研究中样本柚皮苷含量高于药典标准及有关文献报道[19-20]。本研究采用化橘红幼果全果采样，而药典及有关文献采用外果皮及大果，有文献报道，柚皮苷不完全是富集于化橘红外果皮，其果瓤部分同样富集该有效成分[3-4]。本研究也進一步证实了幼果全果含有较高的有效成分。在后续的工作中，可以对幼果做药理学研究，为推广幼果作为药用资源做进一步的理论研究。

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（收稿日期：2018-05-04 本文編辑：孟庆卿）