2014年-2016年全国原种猪场PRRS疫苗使用情况及建议

张 硕，刘颖昳，周 智，徐 琦，吴佳俊，翟新验，杨 林

(中国动物疫病预防控制中心OIE猪繁殖与呼吸综合征参考实验室，北京 102618)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)(又名猪蓝耳病)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍、早产、流产、死胎、木乃伊胎及仔猪呼吸综合征为特征的高度接触性传染病[1]。PRRSV可根据基因型分为美洲型和欧洲型，按临床表现差异，美洲型PRRSV可分为经典PRRSV和高致病性PRRSV。高致病性PRRSV以高度接触性传播、全身出血、肺部实变和母猪繁殖障碍为特征，仔猪、育肥猪和成年猪均可发病和死亡，其中仔猪发病率可达100%、病死率可达50%以上，母猪流产率可达30%以上[2]。

2006年在我国猪群中暴发高致病性猪蓝耳病疫情，给我国养猪业造成巨大的经济损失，为了对该病进行有效的防控，许多单位开始研发针对高致病性猪蓝耳病的疫苗。2007年研发出高致病性猪蓝耳病灭活疫苗用于该病的防控。2009年高致病性猪蓝耳病活疫苗研发成功，并开始广泛使用，并逐渐替代之前的灭活疫苗和经典株活疫苗，进而有效控制了高致病性PRRS的传播和再流行[3]。该病大范围暴发流行逐渐降低，呈零星散发或小范围流行，尤其是在原种猪场，该病基本鲜有报道，因此，许多原种猪场开始停止使用高致病性猪蓝耳病活疫苗进行该病的免疫防控。

为了解和掌握原种猪场猪蓝耳病疫苗使用情况及最新的病原流行情况，对2014年-2016年全国原种猪场PRRS疫苗的免疫策略和病原阳性情况进行统计、检测和分析。根据免疫策略将全国和各个地区猪场分为不免疫、免疫高致病性PRRS活疫苗、免疫经典PRRS活疫苗3个组别，分析不同免疫策略情况下该病病原阳性情况，进而掌握疫苗免疫与疫病流行之间的相关性，根据猪场免疫策略和PRRS病原阳性情况给出该病的防控建议。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 总核酸提取试剂盒(MAGMAX-96 viral isolation kit )，ABI公司产品；胶回收试剂盒(E.Z.N.A.®Gel Extraction kit )，OMEGA公司产品；一步法荧光RT-PCR试剂盒(One step prime scriptTMRT-PCR Kit (Perfect real time))，TaKaRa公司产品；AMV reverse transcriptase、RNase inhibitor、GoTaqDNA polymerase、pEASY-T3 Cloning kit试剂盒，Promega公司产品。

1.1.2 主要仪器 Tissuelyser Ⅱ组织研磨仪，QIAGEN公司产品；KingFisher96磁珠纯化仪，美国Thermo Fisher Scientific公司产品；Tpersonal型PCR仪，德国Biometra公司产品；PAC300型电泳仪，美国Bio-Rad公司产品；MCO-175二氧化碳培养箱，日本三洋电机株式会社产品。

1.2 方法

1.2.1 调研 2014年-2016年分别在全国94、87和87家原种猪场进行调研，内容包括PRRS免疫策略、疫苗种类和毒株等。根据统计结果，将猪场分为不免疫、免疫高致病株、免疫经典株3个组进行分析。采样的原种猪场分布在安徽、北京、福建、甘肃、广东、广西、海南、河北、河南、黑龙江、湖北、湖南、吉林、江苏、江西、辽宁、内蒙、山东、山西、陕西、上海、四川、天津、新疆、云南、浙江、重庆等27个省市自治区，2015和2016年采样地区未包括甘肃。各省市自治区按照如下划分区域并进行统计分析：东北地区：辽宁、吉林、黑龙江；华北地区：河北、山西、内蒙古、北京、天津；华东地区：山东、江苏、安徽、浙江、台湾、福建、江西、上海；华中地区：河南、湖北、湖南；华南地区：广东、广西、海南；西南地区：云南、贵州、四川、西藏；西北地区：新疆、陕西、宁夏、青海、甘肃。

1.2.2 采样 使用扁桃体采样器采集母猪、公猪和后备母猪扁桃体。每个猪场采集样品40份，样品原则上来源于不少于3栋猪舍的猪只，其中包含种公猪5头，经产母猪25头(1胎～2胎5头，3胎～4胎10头，5胎～6胎10头)，后备母猪10头(40 kg～60 kg 5头，90 kg～110 kg 5头)。

1.2.3 检测 扁桃体样品研磨后，2000 r/min离心5 min，上清液提取核酸。采用PRRSV OIE参考实验室建立的PRRSV通用RT-PCR方法对扁桃体样品进行检测(PRRSV通用型检测，简称通检，是指不分型的PRRSV检测，包括美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV)，引物序列为：上游：5′-GAATGGCCAGCCAGTCAATC-3′，下游：5′-GTCGCCCTAATTGAATAGGTGAC-3′，扩增基因片段位于ORF6～ORF7基因的保守位点，预期扩增片段大小为436 bp。反应体系为ddH2O 12.5 μL，5×Green buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 μmol/L Primer 1.5 μL，Gotaq DNA聚合酶1.0 μL，AMV反转录酶0.2 μL，RNAi酶抑制剂0.3 μL。反应程序：42℃ 45 min；94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 10 min。通检阳性样品进行基因分型的鉴定。所有PRRSV通用RT-PCR反应阳性产物回收后，连接至pEASY-T3载体，转化到大肠埃希菌中，送上海英淮捷基贸易有限公司北京实验室测序，通过序列测定结果进行病毒分型。

2 结果

2.1 PRRS疫苗的使用情况

2014年-2016年全国原种猪场PRRS疫苗的使用情况见图1。全国地区包括采样的27个省市自治区，2015和2016年未包括甘肃省；地区划分如下：东北地区：辽宁、吉林、黑龙江；华北地区；河北、山西、内蒙古、北京、天津；华东地区：山东、江苏、安徽、浙江、台湾、福建、江西、上海；华中地区：河南、湖北、湖南；华南地区：广东、广西、海南；西南地区：云南、贵州、四川、西藏；西北地区：新疆、陕西、宁夏、青海、甘肃。全国范围内，未进行PRRS疫苗免疫的猪场2014年14个(14.89%)，2015年25个(28.74%)，2016年22个(25.29%)，比例在2015年上升，2016年略有下降；免疫高致病性株疫苗的猪场2014年35个(37.23%)，2015年34个(39.08%)，2106年25个(28.74%)，比例在2016年略下降，而免疫经典株疫苗的比例从2014年到2015年下降后(47.87%到32.18%)，于2016年上升(45.98%)。

同时对我国不同地区猪蓝耳病疫苗的使用情况进行统计，图1表明，东北、华北、华东、西南4个地区免疫高致病性PRRS疫苗的场数量整体逐年降低；华中、西北地区数量保持不变；华南地区有一定波动。而不免疫和免疫经典PRRS活疫苗的猪场比例在各地区上升，但是二者在不同年份间波动较大。

2.2 PRRS病原阳性情况

2014年-2016年全国原种猪场PRRS病原阳性情况如图2。从全国来看，2014通检阳性场22个(23.40%),2015年为22个(24.24%)，2016年为33个(37.93%)。2014与2015年整体PRRS通检阳性率持平(23.40%和24.24%)，在2016年上升至37.93%(图2A)。

在免疫不同疫苗的猪场中，通检和变异株检出阳性率有所差异。在免疫高致病性PRRS活疫苗的猪场中，2014年、2015年和2016年的通检阳性场数量和阳性率(免疫阳性场数量/免疫场数量)分别为11(31.43%)、9(26.47%)和8(32.00%)；进一步测序得知，变异株阳性场数量和阳性率分别为10(28.57%)、5(14.70%)和4(16.00%)。在免疫经典PRRS活疫苗的猪场中，2014年、2015年、2016年的通检阳性场数量和阳性率分别为9(20.00%)、5(17.86%)和17 (42.50%)；其中变异株阳性场数量和阳性率分别为7(15.56%)、1(3.6%)和12(42.86%)。在不免疫的猪场中，2014年、2015年和2016年的通检阳性场数量和阳性率分别为2(14.29%)、6(24.00%)和8(36.36%)；变异株阳性场数量和阳性率分别为2(14.29%)、5(20.00%)和4(18.18%)。

图1 2014年-2016年各地区，全国PRRSV免疫策略和变化趋势

Fig.1 The vaccination strategy and tendency of PRRSV in different regions of China among 2014-2016

从PRRS通检结果分布来看，通检阳性场的数量在2016年有所上升(20家～31家)，在不免疫的猪场中出现通检阳性。从PRRS变异株结果分布来看，PRRS变异株阳性的猪场数量在2016年有所增加(11家～20家)。在免疫经典株猪场和不免疫的猪场中均出现变异株阳性。而且其阳性率高于免疫高致病性猪蓝耳病疫苗的猪场。

3 讨论

PRRSV具有特殊性，其变异性高，不同基因型毒株的疫苗之间交叉保护不完全，PRRSV经典株活疫苗对高致病性毒株保护力较弱，从2006年发生的“猪高热病”疫情中也可观察到[4]。高致病性毒株减毒活疫苗可有效控制高致病性PRRS的发生与传播，但值得注意的是，该弱毒苗所用毒株的毒力相对较强，在免疫时要严格控制剂量[5-7]。

A.全国地区PRRSV通检阳性和变异株阳性情况；B.PRRSV通检阳性场数量根据免疫策略(不免疫、免疫高致病性PRRS活疫苗、免疫经典PRRS活疫苗)的分布情况；C.PRRS变异株阳性场数量根据免疫策略的分布情况。免疫策略包括不免疫、免疫高致病性PRRSV活疫苗、免疫经典PRRSV活疫苗。

A.The nationwide positive incidence of PRRSV and HP-PRRSV；B.The nationwide PRRSV determination results based on different vaccination strategies；C.The nationwide HP-PRRSV determination results based on different vaccination strategies.There were three vaccination strategies:No vaccination (No vac),vaccination with live HP-PRRSV and vaccination with live PRRSV classical strain.

图2 2014年-2016年全国原种猪场PRRS病原阳性情况

注：“√”说明这一免疫策略可用，包括不免疫、免疫经典株或免疫变异株；“×”说明这一免疫策略不适用。

Notes:"√" indicates that this strategy could be applied,such as no vaccination,vaccination with classic strain and vaccination with variant strain.“×” indicates that this strategy could not be applied.

在本研究中调研的若干家猪场中，有部分猪场病原阳性情况与其采取的免疫策略不相匹配，存在一定风险。例如，在PRRS通检阳性猪场中，在2014年-2016年，分别有2、6和8家猪场未进行免疫，考虑到PRRSV散毒期长，很容易导致病毒扩散，风险较高。在PRRSV变异株阳性猪场中，2014年-2016年分别为7、1和12家猪场仅免疫PRRS经典株活疫苗；而不免疫的猪场在2014年-2016年分别有2、5和4家。变异株种类繁多，部分毒株致病力较强，选择不免疫和免疫PRRS经典株活疫苗的猪场若出现PRRSV变异株阳性，则风险较高。

猪场应根据场内PRRSV情况和生物安全风险选择合适的PRRS免疫策略(表1)，免疫策略与病原阳性情况的匹配程度决定猪场面临的风险[8]。在场内PPRSV控制较好、周边生物安全风险较低的情况下，可考虑不免疫，并持续通过唾液等方式监测病原。在场内PRRSV仅通检阳性、未观察到变异株阳性的情况下，如果周边生物安全风险较低，可考虑免疫经典株减毒活疫苗，并持续监测，确定场内有无变异株感染。如果场内PRRSV持续变异株阳性，应考虑测定毒株序列，选择相应毒株的减毒活疫苗，并严格按照疫苗说明书使用。对PRRS的控制，最终应实现净化。在当前基础上，需先降低变异株阳性率、经典株阳性率，然后根据情况保证生物安全，减少活疫苗的使用，淘汰阳性种猪，最终才可能实现PRRS的净化。

本研究对2014年-2016年全国原种猪场PRRS的免疫情况和病原阳性情况进行统计和分析，明确了猪场应根据场内的实际情况选择合适的PRRS免疫策略，为PRRS的防控和疫苗合理使用提供理论依据。