犀牛钩虫ITS1-5.8S-ITS2基因序列的对比分析

李 朝，李杨杨，宋伟斌，杨玉钊，杨建发，邹丰才，刘永张*

(1.云南农业大学动物医学院/云南省高校兽医公共卫生重点实验室，云南昆明 650201；2.昆明动物园，云南昆明 650021)

钩虫病(Hookworm diseases)是由寄生于人体及猫、狗等大多数哺乳动物小肠内的钩虫引起的寄生虫病，钩虫是肠道寄生线虫中危害最严重的虫种。钩口科(Ancylostomatidae)分为钩口属(Ancylostoma)、仰口属(Bunostomum)、板口属(Necator)、弯口属(Uncinaria)和球首属(Globocephalus)等。感染人体最常见的钩虫为美洲钩虫(Necatoramericanus)和十二指肠钩虫(Ancylostomaduodenale)[1-2]。寄生于猫和狗肠道中常见的钩虫为锡兰钩虫(A.ceylanicum)、犬钩虫(A.caninum)和巴西钩虫(A.braziliense),也可感染人体，导致人兽共患寄生虫病[3-4]。

长期以来，动物寄生虫病原的虫种鉴定主要是基于形态比较、寄生宿主、生活史等传统分类学基础。传统分类方法存在主观性、周期性、局限性等诸多现实因素的限制，所以国内外专家学者开拓运用分子生物学方法，寻找特异保守的标记基因序列进行系统分析。以PCR方法为基础的限制性片段长度多态性PCR(restriction fragment length polymorphism PCR,PCR-RFLP)、随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、单链构象多态性PCR (single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)等技术已广泛应用于寄生虫的分类和鉴定[5-6]。寄生虫的rDNA基因是一个值得选用的分子标记，该基因含18 S、5.8 S和26 S rDNA，其内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)分为ITS-1和ITS-2，前者位于18 S和5.8 S rDNA之间，后者位于5.8 S和26 S rDNA之间。本研究以从云南省某动物园非洲白犀牛粪便中分离的钩虫为研究对象，PCR扩增其ITS1-5.8S-ITS2 rDNA并进行序列分析，旨在为今后野生动物犀牛的钩虫分类、鉴别诊断、分子流行病学调查以及对钩虫病的防控等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体样品 本研究所用的钩虫分离自云南省昆明市动物园内饲养的观赏非洲白犀牛粪便，饱和食盐水漂浮法分离虫卵后镜检、孵化和分离，分别命名为Usten1及Usten2; 保存于750 mL/L酒精中备用 。

1.1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒，血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司产品；PCR试剂，上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 虫体DNA提取 取孵化的2条犀牛钩虫，用灭菌超纯水反复吹打冲洗2次～3次后，将虫体置于新的1.5 mL离心管中，再用超纯水反复冲洗，然后将超纯水吸干净。分别用SDS裂解缓冲液和蛋白酶K消化过夜，然后按DNA提取试剂盒使用说明提取虫体基因组总DNA。

1.2.2 目的基因PCR扩增 扩增犀牛钩虫ITS1-5.8S-ITS2序列的引物为扩增线虫ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 序列的保守引物NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′和NC2：5′-TTAGTTTCT TTTCCTCCGCT-3′[7]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。从单个犀牛钩虫样品的基因组总DNA中经PCR扩增出ITS1-5.8S-ITS2片段，扩增体系为25 μL，PCR反应条件为：94℃5 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环；最后72℃ 5 min。同时设不加DNA模板的阴性对照和加DNA模板的阳性对照(阳性对照样品为同属线虫的捻转血矛线虫核酸)。扩增产物经15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，于紫外透射仪上观察并拍照记录结果。

1.2.3 测序及对比分析 将经PCR鉴定为阳性的扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序，然后用SeqMan5.01软件拼接。在线Blast比对分析，序列上传NCBI- GenBank，与已公布的钩虫ITS1-5.8S-ITS2基因序列，用MEGA6.06软件构分子系统进化树。

2 结果

2.1 虫卵观察结果

采用饱和食盐水漂浮法分离获得虫卵后，在显微镜下检查，虫卵椭圆形，大小通常为79 μm～97 μm×47 μm～50 μm。两端钝圆，胚细胞大而数量少，内含暗黑色颗粒(图1)。

图1 虫卵观察结果(100×)

2.2 ITS1-5.8S-ITS2序列的PCR扩增

以提取的2条单个虫体的基因组为模板，用NC5和NC2作为引物进行PCR扩增，同时设不加DNA模板的阴性对照和加DNA模板的阳性对照，阳性对照样品为同属线虫的捻转血矛线虫核酸。PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，可见约800 bp的条带(图2)， 与预期目的片段大小一致。

M.DNA 标准DL 2 000; 1.Usten1；2.Usten2；-.阴性对照；+.阳性对照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Usten1；2.Usten2；-.Negative control；+.Positive control

图2犀牛钩虫ITS1-5.8S-ITS2 rDNA的PCR产物

Fig.2 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA PCR-amplified from wormhook of rhino

2.3 ITS1-5.8S-ITS2序列分析

测序分析显示， ITS1-5.8S-ITS2基因序列长度均为781 bp，与Uncinariacf.(HE962182)和Uncinariasp.(HQ262066)的同源性分别为99%和98%。因此推测，非洲白犀牛感染的为弯口属钩虫(Uncinaria)，序列上传获得注册序列的登录号是MF784938(781 bp)和MF784939(781 bp)。

目前，在GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)中注册报道的钩虫类ITS1-5.8S-ITS2基因系列有多段，其相关信息(分类、雌雄、宿主、分离地点、基因登录号)详见表1。用表1中所列钩虫的ITS1-5.8S-ITS2基因序列分别构建系统进化树和进行同源性分析。其中，运用最大简约分析(Maximum Parsimony analysis)(图2)、邻接分析(Neighbor-Joining analysis)(图3)构建系统进化树，重复1 000次自展值检验，两者在拓扑结构上基本一致，表明此次分离的虫卵弯口属钩虫(Uncinaria)。

3 讨论

此次样品采集于云南省昆明动物园的非洲白犀牛，雌雄各1头，年龄约4岁，非洲引进。2016年12月下旬抵达中国，隔离检疫40余天后，2017年2月16日运抵昆明动物园。隔离检疫期间，主饲苜蓿草、胡萝卜等，未曾有发病记录。抵达昆明动物园后，主食没有改变，适当增加青草。2017年2月19日，犀牛从粪便里排出寄生虫，线虫、蝇蛆幼虫各一。遂对犀牛消化道寄生虫进行仔细筛查，虫卵数量为雌1100枚/g，雄900枚/g。同期采样送往云南省高校兽医公共卫生重点实验室做进一步的检测分析。通过投喂盐酸左旋咪唑7 g/kg，收到良好效果，此后的9个月内，粪便内没有检测到类似虫卵。以此推断,犀牛从非洲起运前，体内就有该线虫寄生。长途运输、环境改变、饮食规律打乱等因素，导致动物体况、抵抗力下降，诱发体内寄生虫增殖，从粪便中排出虫体。

表1 基于已报道钩虫ITS1-5.8S-ITS2基因系列的物种信息

图3 最大简约分析的系统进化树

图4 邻接分析的系统进化树

为了确定犀牛所感染的线虫种类，采用分子生物学技术进行鉴定分类。ITS是核糖体DNA中介于18 S和28 S之间的内转录间隔区，包括ITS-1和ITS-2两段序列，它具有进化速度快、长度短、在基因组不同单元间一致性好等特点，十分适合进行各种分子操作；同时，它们在生物进化过程中显示种的特征，在种内具有高度保守性，不同种间又有不同程度的差异。因此，ITS是广泛应用于寄生虫种间分类鉴定的理想遗传标记[12-14]。ITS序列分析已被广泛用于研究寄生虫同一科内属间及属下种间的遗传关系。

非洲白犀(Ceratotheriumsimum)又叫白犀牛、方吻犀、宽吻犀等，属奇蹄目，犀牛科，主要分布于非洲东部、南部和亚洲热带地区，其保护级别分别为世界自然保护联盟(IUCN)红色名录(https://www.iucn.org/)列为近危(CR)动物、《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅱ国际二级保护动物。犀牛属草食动物，主要食物为杂草、果实、树叶等，动物自身不能分泌降解粗纤维的酶，其降解主要依赖于消化道中数量庞大的微生物，与反刍草食动物相比，犀牛属于单胃动物，其盲肠和结肠容量较大，容易感染线虫等消化道寄生虫，影响肠道蠕动节律和菌群微生物结构分布，影响消化吸收，引发梗阻，继而影响其生长和繁殖[15-16]。目前，国内外有关犀牛寄生虫的报道极少，国外仅有少量的报道，主要包括血液寄生原虫，如泰勒虫、巴贝斯虫、锥虫等[17-21]，以及消化道寄生蠕虫[22-23]。本研究从非洲白犀牛(Ceratotheriumsimum)粪便中分离鉴定的线虫属于钩虫科弯口属钩虫(Uncinaria)，为野生珍稀动物寄生虫防控、丰富寄生虫物种多样性提供了参考，也为钩虫的进一步分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。