微小RNA—221在非小细胞肺癌中的表达及意义

贺家勇　杨晨晨　徐茜

[摘要] 目的 探讨微小RNA-221（miRNA-221）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及意义。 方法 收集新疆医科大学附属肿瘤医院2010年1月～2011年1月接受肺叶切除+系统性淋巴结清扫的53例NSCLC患者的临床资料。采用实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测上述NSCLC组织及癌旁组织标本中miRNA-221的水平。分析miRNA-221表达水平与各临床病理参数的关系，采用Kaplan-Meier方法分析miRNA-221表达与NSCLC生存期（OS）之间的关系。 结果 miRNA-221在NSCLC组织中的相对表达量为（0.0234±0.0002），在癌旁组织中的相对表达量为（0.0095±0.0003），miRNA-221在NSCLC组织中的相对表达量高于癌旁组织（P < 0.05）。31例miRNA-211相对高表达。TNM分期中Ⅲ期患者miRNA-221的表达量高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P < 0.05）。Kaplan-Meir生存分析结果显示，miRNA-221高表达患者中位OS为36.4个月，miRNA-221高表达与低表达患者OS差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 miRNA-221是潜在的肺癌预后预测分子标志物，miRNA-221可能参与了NSCLC的发生、发展。

[关键词] 微小RNA-221；非小细胞肺癌；表达

[中图分类号] R734 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）11（b）-0097-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of microRNA-221 in non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods A total of 53 NSCLC cases′ clinical material were collected from Cancer Hospital Affiliated of Xinjiang Medical University from January 2010 to January 2011， and all the cases accepted pulmonary lobectomy and systematic mediastinal lymphadenectomy. Levels of miRNA-221 in the NSCLC and adjacent tissues were examined by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （qRT-PCR）. The relationship between expression level of miRNA-221 and clinic pathological parameters were analyzed. Kaplan-Meier was used to analyze the relationship between miRNA-221 expression and overall survival （OS）. Results The relative expression of miRNA-221 in NSCLC tissues was （0.0234±0.0002）， and it was （0.0095±0.0003） in adjacent tissues. The relative expression of miRNA-221 in NSCLC tissues was higher than that in adjacent tissues （P < 0.05）. There were 31 cases having relative higher expression. The level of miRNA-221 was significantly higher in TNM stage Ⅲ than that in TNM stage Ⅰ-Ⅱ（P < 0.05）. Kaplan-Meir survival analysis results manifested that the median OS of patients with miRNA-221 high expression was 36.4 months. There was no significant difference in OS between miRNA-221 low expression and high expression patients（P > 0.05）. Conclusion miRNA-221 is a potential molecular marker for the prognosis of lung cancer， which may be involved in the development and progression of NSCLC.

[Key words] Micro RNA-221； Non-small cell lung cancer； Expression

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的发病占所有肺癌发病的85%，NSCLC患者的5年生存率仍不到15%[1-3]，对NSCLC预后分子标志物的判断有助于NSCLC的早期诊断和提高患者的总生存时间[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为24～25个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA[5]，多项研究证明miRNA在癌症的发生、发展中起重要作用[6-8]。miRNA通过结合mRNA3′-UTR非翻译区（3′-UTR）导致mRNA的降解或翻译抑制而调控靶基因的表达。miRNA-221是其中重要的miRNA，研究表明，miRNA-221是一种致癌miRNA[9-10]，miRNA与肺癌的关系文献目前鲜有报道。本研究回顾性分析53例NSCLC患者的临床资料，检测miRNA-221在肺癌组织中的表达情况，探讨miRNA-221与肺癌的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

筛选新疆医科大学附属肿瘤医院2010年1月～2011年1月接受标准肺癌根治术（肺叶切除+系统性纵隔淋巴结清扫）的NSCLC鳞癌腺癌患者106例，并进行电话随访。纳入标准：完成随访病例；Ⅱ、Ⅲ期[11]患者术后接受过系统性含铂方案两药联合化疗4周期；Ⅰ期患者术后随访至肿瘤复发后才接受全身化疗；有癌组织和癌旁组织病理标本的患者。共纳入53例，平均年龄（55.8±9.7）岁；男29例，女24例；Ⅰ期患者25例，Ⅱ期16例，Ⅲ期12例（UICC第2007版）；鳞癌24例，腺癌29例。

1.2 随访情况

53例NSCLC患者术后采用电话随访形式。随访时间自手术之日起，至2017年1月1日。终点事件为患者死亡。评价指标为患者1、2、3年总生存（OS）率。

1.3 主要仪器及试剂

miRNA反转录试剂（Thermo，立陶宛），miR cute miRNA提取分离试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]，荧光定量PCR仪[罗氏诊断产品（上海）有限公司，型号：IQ5]，台式高速冷冻离心机（Eppendorf艾本德中国有限公司，miRNA-221引物、内参U6引物[宝生物（大连）有限公司]，紫外分光光度仪（上海棱光技术有限公司）。

1.4 实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）方法

1.4.1 蜡块组织总RNA提取 采用miRNAeasy总RNA提取试剂盒提取NSCLC及癌旁正常石蜡组织总RNA，操作严格按照说明书进行，测定每个样本在OD260/OD280 nm处的吸光度值，核酸蛋白检测要求A260/A280在1.8～2.0之间，计算miRNA的浓度。将提取的DNA用cDNA试剂盒反转录成cDNA，样本置-80℃冰箱保存。

1.4.2 RT-PCR检测 PCR总反应体系：20 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，其余加ddH2O补足，2×qPCR Mix 10 mL，以U6为内参，扩增条件：95℃预变性3 min，然后95℃ 20 s、60℃ 20 s、72℃ 40 s，进行40个循环，获得Ct值。miRNA各引物序列见表1。

1.4.3 数据分析 分析目的基因的表达水平是以U6作为内源参照。△Ct（n）=目的基因Ct（n）均数-参照基因Ct（n）均数；△△Ct（n）=△Ct（n）-△Ct（1）；然后算出2-△△Ct。将2-△△Ct中位数作为分界值（0.0124）。将患者分为miRNA-221低表达组和高表达组，≥0.0124为高表达组，<0.0124为低表达组。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析，癌组织及癌旁组织中的miRNA的表达量比较采用t检验，分析miRNA-221表达与临床病理学参数的关系采用χ2检验，采用Kaplan-Meir方法进行生存分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-221在肺癌及癌旁组织中的表达情况

采用2-△△Ct法计算出miRNA-221相对内参U6的相对表达量，结果显示，相对于内参U6，miRNA-221在NSCLC组织中的相对表达量为（0.0234±0.0002），在癌旁組织中的相对表达量为（0.0095±0.0003），miRNA-221在NSCLC组织中的相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 miRNA-221与NSCLC临床病理学特征的关系

53例NSCLC组中，32例miRNA-211相对高表达，统计结果显示，miRNA-211的表达与患者年龄、性别、吸烟情况、病理类型无关（P > 0.05）。而miRNA-221的表达与患者TNM分期有关，TNM分期Ⅲ期miRNA-221的表达量高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 不同miRNA-221水平NSCLC患者的生存分析

Kaplan-Meir生存分析结果显示，miRNA-221高表达患者中位OS为36.4个月，miRNA-221高表达与低表达患者OS差异无统计学意义（P = 0.544）。见图1。

3 讨论

越来越多的研究表明，miRNA可作为潜在的癌基因（OncomiR）或抑癌基因。miRNA-221和miRNA-222是两种亮度同源的miRNA，miRNA-221属于miRNA-221/222家族，miRNA-221编码的基因位于染色体XP11.3[12-15]，miRNA-221与多种肿瘤有关，如miRNA-221在大多数上皮性肿瘤中过表达[16]，并且miRNA-221可能是上皮瘤治疗的潜在靶点。Galardi等[17]研究显示，在前列腺癌细胞中miRNA-221出现过表达，导致细胞增殖，并导致细胞周期的改变。在恶性胶质癌、甲状腺乳头状癌、乳腺癌、肝细胞癌中也得到了证实。吴展陵等[18]研究结果显示，miRNA-221过表达能够增强NSCLC NCI-H1299细胞的活力和增殖能力，P27是NCI-H1299细胞中miRNA-221的靶基因，两者存在负调控关系，提示miRNA-221可以促进NSCLC NCI-H1299细胞的生长，可作为NSCLC基因治疗的靶点。

本研究采用qRT-PCR的方法统计了53例NSCLC组织及正常组织的miRNA-221表达水平，发现miRNA-221在NSCLC癌组织中的表达明显高于癌旁组织，miRNA-221在NSCLC中的表达与肿瘤临床分期相关，临床分期为Ⅲ、Ⅳ期患者miRNA-221阳性表达水平明显高于临床分期Ⅰ、Ⅱ期。进一步分析结果显示，miRNA-221在不同年龄、性别、组织学类型、病理特征间的表达水平，差异无统计学意义（P > 0.05），因此miRNA-221可能参与了NSCLC的发生、发展。另外，miRNA-221与NSCLC的预后有关，miRNA-221低表达的患者OS长，吕俊杰等[19-21]研究报道，miRNA-211高表达组中位OS为35.34个月，较miRNA-221低表达组（平均48.72个月）明显缩短，两组OS差异有统计学意义（Log-rank检验：P = 0.006）。miRNA-221在一定程度上可作为NSCLC的肿瘤标志物。本研究结果显示，miRNA-221高表达组患者较miRNA-221低表达组患者中位OS短，但差异无统计学意义（P > 0.05），这与吕俊杰等[19]报道有一定差异，可能与病例来源不同或者病例数量较少有关，还需进一步的研究。

miRNA-221对NSCLC细胞增殖、周期的影响以及可能与哪种基因存在靶向调控关系，仍需进一步研究。本研究提示miRNA-221与NSCLC细胞周期、凋亡有关，在细胞水平验证了miRNA-221的作用。此外，miRNA可以特异性地识别靶mRNA的3′-非翻译区（3′-UTR），并与之结合，促进靶基因的降解或翻译、抑制而发挥负调控基因表达的作用[22-24]。相关研究[25-26]报道，miRNA-221通过与靶基因PTEN的3′-UTR结合通过上调PTEN，在口腔鳞状细胞癌中起到促进凋亡的作用，后续可进行miRNA-221与靶基因调控作用的研究。

综上，miRNA-221在NSCLC中的表达量明显上调，提示miRNA-221在NSCLC中充当癌基因作用，并且在肿瘤发生、发展中可能发挥促癌作用，可作为一个潜在的预测预后因素。

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（收稿日期：2018-04-25 本文编辑：金 虹）