GPER、ERα及ERβ在甲状腺乳头状癌中的表达与临床特征关系

刘星伟 林志东 李毅

[摘要] 目的 探讨新型雌激素受体-G蛋白偶联受体与ERα、ERβ在甲状腺癌组织中的表达特征及其与患者临床资料的相关性。 方法 选取2014年2月～2017年9月我院普通外科85例甲状腺乳头状腺癌组织标本，平均年龄38.7（23～77）岁，对组织标本进行免疫组化染色，分析甲状腺癌组织中G蛋白偶联受体、ERα及ERβ的表达特征。 结果 甲状腺乳头状癌组织中GPER、ERα及ERβ阳性表达率分别为63.5%、71.8%、67.1%，呈高表达状态；但这三种雌激素受体表达的阳性率与患者年龄、性别、肿瘤分期、淋巴结转移状态、肿瘤大小等无明显相关；GPER与ERα及ERβ的表达呈正相关。 结论 三种雌激素受体包括G蛋白偶联受体、ERα及ERβ均與甲状腺癌的发生、发展密切相关，是极具研究价值的潜在治疗靶点。

[关键词] 甲状腺癌；雌激素受体；G蛋白偶联受体；ERα；ERβ；免疫组织化学

[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）25-0020-03

[Abstract] Objective To investigate the expression characteristics of novel estrogen receptor-G protein coupled receptors， ERα and ERβ in thyroid carcinoma tissues and their correlation with clinical data. Methods A total of 85 specimens of thyroid papillary adenocarcinoma in the general surgery of our hospital from February 2014 to September 2017 were collected. The average age of patients was 38.7（23-77） years old. Immunohistochemical staining of tissue specimens was performed. Expression characteristics of G protein-coupled receptors， ERα and ERβ in the thyroid cancer tissues were analyzed. Results The positive expression rates of GPER， ERα and ERβ in papillary thyroid carcinoma were 63.5%， 71.8%， and 67.1%， respectively， showing high expression status. However， there was no significant correlation between the positive rates of these three estrogen receptors and age， gender， tumor stage， lymph node metastasis status， tumor size， etc. GPER was positively correlated with ERα and ERβ expression. Conclusion The three estrogen receptors including G protein-coupled receptors， ERα and ERβ are closely related to the occurrence and development of thyroid cancer， and are potential therapeutic targets with great research value.

[Key words] Thyroid carcinoma； Estrogen receptor； G protein-coupled receptor； ERα； ERβ； Immunohistochemistry

研究显示甲状腺恶性肿瘤在女性中的发病率高于男性，可达3～4倍，据此不难推断雌激素很可能与甲状腺癌的发生发展有密切关联[1，2]。部分研究证实雌激素可通过与两个雌激素受体（estrogen receptor）ERα及ERβ的相互作用来表现其生理和病理生理作用，ERα及ERβ是作为配体激活的转录因子[3]，一种独立于核受体ERα和ERβ的新型雌激素受体-G蛋白偶联受体-GPER（G protein-coupled estrogen receptor）已被确定为ER家族的新成员，其能够以较高的亲和力结合雌激素，并通过下游级联介导反应触发对雌激素的反应[4，5]。为探讨它们在甲状腺癌尤其是甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma PTC）中的作用，本研究通过免疫组织化学方法检测85例甲状腺乳头状癌组织中GPER、ERα及ERβ的表达，分析其与PTC临床病理特征之间的相关性，探讨不同雌激素受体与甲状腺乳头状癌发生、发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取我院病理科2014年2月～2017年9月石蜡包埋甲状腺乳头状癌标本85例，组织片厚5 μm，GPER、ERα及ERβ进行免疫组化检测。所有患者均为我院普通外科住院患者，接受甲状腺癌手术，临床及病理资料保存完整。其中男20例，女65例，年龄38.7（23～77）岁。术后送病理科进行切片及染色，由病理医师阅片，按TNM肿瘤分期标准将患者分为Ⅰ期41例、Ⅱ期22例、Ⅲ期17例、Ⅳ期5例。

1.2 主要试剂及仪器

主要试剂及仪器包括：二甲苯、中性树脂、苏木素、无水乙醇、免疫组化染色试剂盒、鼠抗人ERα单克隆抗体、鼠抗人ERβ单克隆抗体、GPER兔抗人多克隆抗体、DAB显色剂、精密pH计、光学显微镜、光学相机、石蜡切片机、烤片机、捞片机、恒温烤箱等。

1.3 实验步骤

二甲苯脱蜡，系列酒精逐级脱水，PBS冲洗→切片浸入柠檬酸缓冲液中，加热至98℃持续15 min后冷却，PBS冲洗→50 μL 3%H2O2，室温下15 min，PBS冲洗→50 μL封闭山羊血清工作液，37℃孵育15 min→50 μL一抗，PBS空白对照，37℃孵育2 h，PBS冲洗→50 μL羊抗兔IgG溶液，37℃孵育15 min，PBS沖洗→50 μL辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS冲洗→DAB溶液显微镜下显色→苏木素复染，酒精脱水，中性树胶封固。

1.4 结果判定

免疫组化结果由2名病理医师分别评分，如结果不一致则重新阅片评估。按照染色程度及高倍视野下阳性细胞数来进行评分：①细胞染色程度：所有细胞均未染色计0分，染色细胞呈弱阳性计1分，呈中等阳性计2分，呈强阳性计3分；②高倍视野下阳性细胞数：随机选取肿瘤细胞染色阳性区域5个高倍视野计数，计数不少于100个肿瘤细胞，观察阳性表达率，不到1%计1分，1%～10%计2分，11%～33%计3分，34%～66%计4分，67%～100%计5分。上述2项评分相加总分为5～8分者计阳性，否则计阴性。

1.5 统计学方法

用SPSS16.0统计软件分析系统进行统计学处理，计数资料采用χ2检验、Fisher精确概率检验，相关性采用Spearman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GPER、ERα及ERβ与临床病理特征的关系

甲状腺乳头状癌组织中GPER、ERα及ERβ阳性表达率分别为63.5%（54/85）、71.8%（61/85）、67.1%（57/85），这三种雌激素受体表达的阳性率与患者年龄、性别、肿瘤分期、淋巴结转移状态、肿瘤大小等无明显相关（P>0.05）。见表1。

2.2 GPER表达与ERα、ERβ表达的相关性

GPER在甲状腺乳头状癌中表达与ERα、ERβ呈正相关，两者相关系数分别为0.264、0.372（r=0.264，P=0.003；r=0.372，P=0.0015）。见表2。

3 讨论

GPER在全身多个器官及组织中广泛表达，研究显示其在肿瘤细胞系中常呈现高表达状态，尤其取自侵袭性肿瘤组织的材料[4]。雌激素结合其特异受体可以使靶细胞发生许多变化，其主要作用途径有两条：基因途径和非基因途径[6]。基因途径指雌激素与其特异性受体结合来促使受体发生改变，所形成的复合物结合到靶基因启动子的雌激素反应因子上，激发共调控蛋白来启动靶基因转录形成信使RNA，进而翻译蛋白产生作用，这是一个耗时达数小时的过程。而非基因途径耗时极短，可在几分钟内完成。雌激素通过结合细胞质膜上的雌激素受体或其他受体蛋白，导致诸多的细胞变化如多种蛋白激酶级联反应激活、钙离子增加等。这一过程并不是通过新产生的蛋白来完成的，而是与GPER激活有关。这两个途径并不是独立的，它们之间有交叉作用，协同反应可促进癌细胞的增殖。研究人员通过将人类WRO和FRO甲状腺癌细胞系中GPER的表达与MCF-7乳腺癌细胞系中GPER阳性的表达[7，8]对比后发现，甲状腺癌细胞系与MCF-7细胞系中GPER表达水平非常相似。研究证实镉能够通过GPER/ERK/AKT/NF-κB信号通路诱导GPER阳性甲状腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，而阻断GPER激活后可显著降低镉对GPER阳性甲状腺癌细胞的雌激素样作用[9]。

大多学者认为甲状腺组织表达ER，相关研究亦证实甲状腺癌组织雌激素受体表达率远高于良性甲状腺疾病及正常甲状腺组织。李飞等[10]通过对101例甲状腺癌组织中雌激素受体表达检测发现，GPER、ERα及PR在多种病理类型的甲状腺癌组织中均可检测到，且GPER与ERα在组织标本中同时表达的比例较高，说明这两个受体的表达具有正相关。吴婷婷等[11]证实甲状腺未分化癌FRO细胞的增殖是由于ERK1/2、PI3K-Akt途径被激活，正是E2通过GPER来激活完成的。在育龄期的妇女PTC患者中，一般是指18～45岁阶段的女性，ERβ1表达较同年龄段男性患者低（P<0.05），而ERβ2表达则高于男性（P<0.05），显然ERβ的两个亚型在甲状腺癌发生发展中的作用是完全相反的[12]。Tang C等[13]通过研究129例PTC，61例结节性增生和118例正常甲状腺组织标本中的GPER1、EGFR和CXCR1蛋白表达水平，发现这三种分子的蛋白质表达水平在PTC中上调，而且GPER1、EGFR和CXCR1的高蛋白表达与淋巴结转移（LNM）显著相关，并得出结论PTC中GPER1、EGFR和CXCR1表达的评估可能有助于预测LNM的风险。Liu J等[14]研究认为，甲状腺癌组织中尤其是低分化或未分化甲状腺癌中ERβ阳性表达率显著降低，这与本研究结果不同。

本研究通过对85例甲状腺乳头状癌组织的检测发现，GPER、ERα及ERβ阳性表达率分别为 63.5%、71.8%、67.1%，GPER、ERα及ERβ在甲状腺癌组织中的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移状态、临床分期等临床特征无统计学差异（P>0.05），GPER表达阳性率与ERα及ERβ的表达呈正相关，证实了GPER是甲状腺乳头状癌发病的重要因素。虽然Chen GG等[15]研究同样在PTC细胞中检测到ERα和ERβ的阳性表达，但其认为不同患者的组织表达有差异，绝经前的女性甲状腺癌组织中ERα阳性表达较其他年龄段的女性和男性的表达率均高。尽管目前对于雌激素可能存在的影响PTC发病的研究并没有统一结论，而雌激素受体GPER、ERα及ERβ在PTC中的表达检测也存在不同结果，本研究结果证实GPER、ERα及ERβ在PTC中均有表达，提示雌激素可能通过相应的雌激素受体，刺激甲状腺细胞生长增殖，参与甲状腺癌的发生发展。本研究结果提示GPER作为PTC治疗靶点的可能，但具体参与甲状腺癌发生发展的机制仍需进一步研究。

[參考文献]

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[11] 吴婷婷，龙方懿，贾朝莉，等. G蛋白偶联受体在雌激素诱导人甲状腺未分化癌FRO细胞增殖中的作用及其机制[J]. 第三军医大学学报，2011，33（2）：164-168.

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[15] Chen GG，Vlantis AC，Zeng Q，et al. Regulation of cell growth by estrogen signaling and potential targets in thyroid cancer[J]. Curr Cancer Drug Targets，2008，8（5）：367-377.

（收稿日期：2018-06-06）