酶辅助闪式法提取莲蓬中原花青素的工艺研究

王建美 高红 徐巧娜

[摘要] 目的 研究闪式提取法提取莲蓬中的原花青素的工艺条件。 方法 以莲蓬中原花青素得率为评价指标，单因素试验考察提取溶剂乙醇的体积分数、提取时间、提取次数、料液比等对莲蓬中原花青素提取工艺的影响。以乙醇体积分数、料液比、提取时间及空白为考察对象，进行四因素三水平的正交试验。确定最佳提取工艺参数。 结果 最佳工藝条件为：乙醇的体积分数为60%，提取时间为3 min，液料比40∶1。 结论 采用最佳工艺条件，莲蓬原花青素得率为8.12%，与传统提取法比较具有高效、省时等优点。

[关键词] 原花青素；莲蓬；闪式提取；正交试验；紫外分光光度法

[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（a）-0025-04

[Abstract] Objective To research on extraction process of proanthocyanidins from seedpod of lotus with homogenate extraction method. Methods Taking the proanthocyanidins yield of seedpod of lotus as the evaluation index， single factor test was used to investigate the effect of volume fraction of solvent extraction， ethanol extraction time， extraction times and solid-liquid ratio on the extraction of procyanidins from seedpod of lotus. The orthogonal tests of four factors and three levels were carried out with ethanol volume fraction， material liquid ratio， extraction time and blank as the object of study. The optimum extraction process parameters were determined. Results The results showed that the optimum process conditions were as followed， the volume fraction of ethanol was 60%， the extraction time was 3 min， and the liquid material ratio was 40∶1. Conclusion With this condition， the proanthocyanidins yield of seedpod of lotus is 8.12%. Compared with the traditional extraction method， the flash method has the advantages of high efficiency and less time.

[Key words] Procyanidins； Seedpod of lotus； Homogenate extraction； Orthogonal test； Ultraviolet spectrophotometry

莲蓬是睡莲科莲属多年生水生草本植物莲（Nelumbo nucifera Graertn.）的成熟花托，其作为莲产品的副产物，资源十分丰富，但在莲加工过程中常常被作为垃圾丢弃。有报道[1-6]，莲蓬中含有较为丰富的原花青素。原花青素是国际上目前公认最有效的清除人体内自由基的天然抗氧化剂，其自由基清除能力和抗氧化功能是维生素E和维生素C的数十倍，能预防和治疗八十多种因自由基引起的疾病，同时也能改善人体微循环[7-9]。此外，它还有抗炎、抗衰老、抗癌变、保护心血管、防止动脉硬化和调节免疫等功能[10-15]。由于原花青素强大的抗氧化活性，以及易溶于极性溶剂，再加上其颜色鲜艳亮丽等特点，符合人们回归自然的需求，常被作为原料或添加剂应用到日化用品、食品、保健品等领域。目前，原花青素的提取方法有水溶剂提取法、有机溶剂提取法、超声提取法、微波提取法、超临界提取法等[16-20]。各提取方法都存在一些优缺点。酶解闪提法是在酶解提取的基础上，应用闪式提取器破碎植物组织，从而使有效成分从植物体中大量溶出的一种提取方法，具有快速、简便、无需加热等特点。本实验采用单因素试验和正交试验优选莲蓬中原花青素的酶辅助闪式提取工艺，为莲蓬中原花青素的工业提取法和莲产业资源的综合开发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

JHBE-50T闪式提取器（河南金鼎科技发展有限公司）；SB30001电子天平（上表电子仪器厂）；721型紫外可见分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）；EYELA SB-1100旋转蒸发仪；HH-2数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；101型电热恒温干燥箱（中国龙口市先科仪器公司）。

1.2 试药

莲蓬：采摘于浙江省金华市武义县，经金华职业技术学院医学院药学部中药专业施淑琴副教授鉴定为睡莲科莲属植物莲的成熟花托；原花青素对照品（纯度≥98%，Lot160619）：上海盛中医药化工有限公司；纤维素酶（50 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；香草醛（20140726）、甲醇（20161017）、乙醇（20151218）、浓盐酸（20150412）均为分析纯；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 对照品的制备

精密称取原花青素对照品10.5 mg，置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，摇匀，得1.05 mg/mL的原花青素对照品贮备液，备用。

2.2 供试品溶液的制备

采用闪式提取法[21]。将新鲜莲蓬用干燥箱烘干，干品过40目筛，准确称取该干莲蓬粉10 g，放入锥形瓶中，加入纤维素酶，酶量为2%，加适量水，50℃酶解1 h，放入提取罐中，按一定的料液比加入提取溶劑，称量，闪式提取一定时间，用提取液补足减少的重量，过滤，得莲蓬提取液，精密移取该品1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，得供试品溶液。

2.3 原花青素标准曲线的绘制

精密移取贮备液，配置成浓度为0.0525、0.105、0.1575、0.210、0.315、0.630 mg/mL的系列对照品溶液。精密移取上述对照品溶液和空白对照（甲醇溶液）各1 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入质量分数为3%香草醛-甲醇溶液3 mL和浓盐酸溶液1.5 mL，摇匀，在25℃条件下避光显色30 min，取出，用空白对照调零，使用紫外可见分光光度计在500 nm处测定吸光度值（A）。以A为纵坐标，以溶液浓度（C）为横坐标，绘制原花青素标准曲线。得线性回归方程：A = -0.1300+3.653C，线性范围为0.0525～0.315 mg/mL，r = 0.9997，线性关系良好。

2.4 供试品中原花青素浓度测定和莲蓬原花青素得率计算

供试品溶液按“2.3”项方法测定吸光度，并根据标准曲线的回归方程计算供试品溶液中的原花青素浓度。得率计算公式如下：得率=提取液中原花青素质量/莲蓬投料量×100%。

2.5 正交试验

由于提取过程中各因素的相互作用会引起得率的变化，而单因素试验不能反映各因素间的相互作用，因此，根据单因素试验，选取对闪式提取工艺有影响的主要因素（乙醇体积分数A、提取时间B、料液比C），设计因素水平表，以莲蓬中原花青素的得率为指标，采用L9（34）正交设计表优化其闪式提取工艺。见表1。

2.6 各影响因素对莲蓬中原花青素提取率的影响

2.6.1 乙醇体积分数的影响 取处理好的莲蓬各10 g，分别加入体积分数为10%、20%、50%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液200 mL，采用提取电压70 V，提取时间2 min，提取次数1次的条件下，按前述“2.2”实验方法进行实验，计算莲蓬中原花青素得率，重复试验3次。结果显示，莲蓬中原花青素得率随着乙醇体积分数的增加而提高，当乙醇体积分数达到60%时，得率最高；继续增加乙醇体积分数时，得率并未增加反而有所下降。故正交试验选取乙醇体积分数为50%、60%和70%进行考察。

2.6.2 提取时间的影响 取处理好的莲蓬各10 g，加入体积分数为60%的乙醇溶液200 mL进行闪提，提取电压70 V，提取次数1次，提取时间分别为0.5、1、2、3、4、5 min，得提取液样品。再按前述“2.3”实验方法进行吸光度测定，并计算莲蓬中原花青素得率，重复试验3次。结果显示，莲蓬中原花青素得率随着提取时间的增加而先提高后降低，在2 min和3 min时达到最高。随着时间进一步延长降低的原因可能是连续高速机械搅拌和剪切，使得提取液局部温度升高，导致一部分原花青素被氧化破坏。因此，正交试验选取提取时间1、2、3 min进行考察。

2.6.3 液料比的影响 取处理好的莲蓬各10 g，按料液比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1加入体积分数为60%的乙醇溶液进行闪提，提取时间2 min，提取电压70 V，提取次数1次，得提取液样品。再按前述“2.3”实验方法进行吸光度测定，并计算莲蓬中原花青素得率，重复试验3次。结果显示，莲蓬中原花青素得率随料液比增加而提高，但当料液比达到20∶1时，得率趋向平行，也就是说料液比20∶1与70∶1未见显著差异，故正交试验选取料液比20∶1、30∶1和40∶1进行考察。

2.6.4 提取次数的影响 取处理好的莲蓬各10 g，加入体积分数为60%的乙醇溶液200 mL，以提取时间2 min，提取电压70 V，提取次数分别为1、2、3、4次进行提取，合并提取液得各提取液样品。再按前述“2.3”实验方法进行吸光度测定，并计算莲蓬中原花青素得率，重复试验3次。结果显示，莲蓬中原花青素得率2次提取比1次有所增加，但再增加提取次数如3、4次时并未随着提取次数的增加有显著提高，几乎呈直线状，这可能与紫外分光光度法的测量误差有关。但乙醇溶剂消耗成倍数增长，且浓缩纯化耗时较多，故为了节约时间及能源，正交试验中提取次数统一为1次。

2.7 正交实验结果

根据单因素试验结果设计的表1进行试验，实验结果进行数据分析得各水平平均值（均值1、2、3）及各因素的极差，见表2。由表2可知，闪式提取工艺各因素对莲蓬中原花青素得率影响的程度依次为A>B>C，即乙醇体积分数>提取时间>料液比，乙醇体积分数（A）对莲蓬中原花青素得率影响最大，3个因素对莲蓬中原花青素的闪式提取得率的最佳工艺条件为A2B3C3，即用60%体积分数的乙醇，按40倍的液料比闪式提取3 min。对正交试验结果的3个因素进行显著性检验，结果见表3。由表3可知，酶解闪式提取莲蓬中原花青素的正交试验中，乙醇体积分数对原花青素的提取率达到极显著水平，另外提取时间和料液比2个因素的影响为显著。根据正交实验优化所得的工艺组合（A2B3C3）进行3次平行验证实验，其平均得率为8.12%。

3 讨论

通过单因素实验选取适当的水平范围，进行酶辅助闪式提取莲蓬原花青素的正交实验，以优化提取工艺，获得最优工艺条件是：乙醇体积分数60%，液料比40∶1，闪式提取时间3 min，其中各因素的影响顺序是乙醇体积分数>提取时间>料液比。采用此工艺条件实验，莲蓬原花青素的平均得率为8.12%。与周芸[22]实验中采用传统的单纯水蒸气蒸馏法提取的得率（5.89%～6.19%）和乙醇回流提取的得率（6.65%～7.26%）比较，在没有降低原花青素提取得率的情况下，缩短了提取时间（回流提取法1次2 h，一般需提取2次），而闪式提取法只需要1～3 min，能提高提取效率。酶解闪式提取法提取莲蓬中的原花青素可获得较好效果。这是因为酶解闪式提取法是在传统溶剂法提取的基础上，根据植物细胞壁的构成，利用酶的反应所具有的高度专一性特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分降解或水解，破坏细胞壁结构，使构成植物细胞壁等不易利用的植物纤维分解成葡萄糖，从而有利于有效成分从植物中溶出，本实验将再通过闪式提取技术，即依靠高速机械剪刀力和超动分子渗透，在常温及溶剂存在下几秒钟内把莲蓬破碎至细微颗粒，使原花青素快速的被乙醇分子包围、解离、替代，最后脱离莲蓬进入溶剂中，原花青素迅速达到组织内外平衡，从而实现快速、高效、高得率的提取目的。本实验结果可为酶辅助闪式提取的大规模工业应用提供参考和依据。酶解闪式法需要专门的设备-闪式提取器，这是一种新型的提取设备，适用于中草药叶、花、根、茎、果实等的提取，既可用于单味中药提取，又可用于复方中药提取，具有提取时间短、可避免有效成分受热破坏的等优点。但需注意的是，由于没有类似仪器设备的操作经验参考，使用时如操作不当，不仅达不到预期的提取效果还可能损坏设备。

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（收稿日期：2017-11-24 本文编辑：张瑜杰）