产纤维素酶菌株的筛选与鉴定及发酵条件优化研究

李美霖 郭东会 冯惠萍

摘要 从枯树叶及其覆盖的土壤中筛选分离分解纤维素的菌株并进行16S rRNA鉴定，优化其发酵条件。采用CMC-刚果红染色法初筛分解纤维素的菌株，用显微镜观察其形态结构，用16S rRNA序列分析其系统分类地位。单因素试验确定氮源、碳源、pH值和温度对发酵液中羧甲基纤维素酶（CMC）、滤纸酶（FPA）活力的影响。结果表明，分离到1株高效分解纤维素的菌株SKX-1，鉴定SKX-1为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）；最优发酵条件为以蛋白胨为氮源、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为碳源，温度37 ℃，pH值为7，发酵培养后，CMC酶活力达到173.3 U/mL，FPA酶活力达到210.5 U/mL。该试验为菌株Bacillus cereus SKX-1的利用提供了理论基础。

关键词 蜡样芽胞杆菌；菌株SKX-1；16S rRNA；发酵条件；优化；纤维素酶

中图分类号 TQ925 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）19-0234-03

Abstract Bacterial strains of decomposing cellulose were screened from dead leaves and their covered soil and identified by 16S rRNA.The fermentation conditions were optimized.CMC-Congo red staining was used to screen decomposing cellulose strains，and its morphological structure was observed by microscope.Its systematic classification status was analyzed by 16S rRNA sequence.The effect of nitrogen，carbon，pH and temperature on the activity of CMC and FPA in fermentation broth were determined by single-factor test.The results showed that a strain of high-efficiency cellulose-decomposing（SKX-1） was isolated and identified as Bacillus cereus.The optimal fermentation condition for SKX-1 was taken peptone as nitrogen source，and CMC-Na as carbon source，the activity of CMC and FPA were 173.3 U/mL and 210.5 U/mL under the fermentation conditions of 37 ℃，pH=7.This experiment could provide a theoretical basis for the application of Bacillus cereus SKX-1.

Key words Bacillus cereus；SKX-1；16S rRNA；fermentation condition；optimization；cellulase

纖维素在地球上分布广泛、蕴藏量丰富，普遍存在于植物中，具有可再生性，是可再生资源[1]。通过纤维素酶水解成葡萄糖等物质，进一步发酵生产酒精、单细胞蛋白、有机酸等人类急需的能源食物和化工原料等，不仅使纤维素得到了再次利用，而且对缓解人类食物紧缺以及化工原料等的枯竭具有重要意义。分解纤维素的菌株产生的酶广泛应用于食品工业、饲料工业、纺织工业、造纸工业以及洗涤剂、医药等众多领域。

近年来，能源和环境问题越来越受到人们的关注和重视，纤维素酶既可用于降解秸秆生产乙醇等新型能源，又可用于辅助秸秆还田，因而也日益受到关注[2-4]。但是，就目前而言，现有的纤维素酶产酶菌株的活力还远远不能满足人们生产生活的需要，而且其生产成本过高，不能广泛应用和大量生产。因此，选育酶活力强且高产的产纤维素酶菌株将会对人们的生产生活产生重要影响。

目前，很多能够产生纤维素酶的生物尚未被人类发现和应用。因此，筛选分解纤维素的菌株对生产实践具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

分解纤维素的菌株分离供试材料为泰山医学院化学实验楼后山楂树下的土壤。

1.2 培养基

（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。葡萄糖20 g，马铃薯200 g，琼脂20 g，自来水1 000 mL，自然pH值。

（2）种子培养基。葡萄糖20 g，马铃薯200 g，自来水1 000 mL，自然pH值。

（3）筛选培养基。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化钠5 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g，琼脂20 g，自来水1 000 mL，自然pH值。

（4）发酵培养基。CMC-Na 10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化钠5 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g，自来水1 000 mL，自然pH值。

1.3 菌种的分离与纯化

称取新取的土壤样品0.5 g于灭菌后的锥形瓶中，加入100 mL无菌水混合均匀后，于摇床28 ℃、200 r/min振荡培养72 h，稍作静置后吸取上清液进行梯度稀释，在筛选培养基平板上涂布稀释液，放入培养箱28 ℃培养3 d后，周围出现透明圈的菌落即为分解纤维素菌的菌落，将其挑出并接种到筛选培养基上进行多次筛选和纯化操作。然后将经过反复多次筛选和纯化后有透明圈的产纤维素酶菌株接到PDA培养基上培养3 d，用刚果红溶液（1 mg/mL）覆盖培养基上长出的菌落，20 min后弃去刚果红溶液，再将NaCl溶液（1 mol/L）倒入其中，15 min后倒掉NaCl溶液，测量其透明圈的直径与菌落直径之比[5]。

1.4 菌种鉴定与保藏

1.4.1 形态观察。肉眼观察并记录菌株的形态，根据观察到的菌株形态对菌株的种类进行大体判断。

1.4.2 PCR扩增16S rRNA序列。以培养后菌株的DNA为模板，2条引物分别为5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′和5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，进行PCR扩增16S rRNA序列。PCR反应体系共25 μL（TaqDNA聚合酶0.5 μL，模板1 μL，引物各1 μL，10×buffer 2.5 μL，双蒸水17 μL，dNTP 2 μL）。PCR扩增步骤：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。在5 μL PCR产物中加入6×buffer 1.5 μL进行凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）。将琼脂糖凝胶电泳中显示出条带对应的PCR产物送到生工生物工程股份有限公司进行测序。在NCBI上通过BLAST程序将上述PCR产物测序得到的序列与已知16S rRNA序列进行比对[6]，比较所测序列与已知序列的同源性。

1.4.3 菌种保藏。将筛选出的菌株转接到斜面培养基上，置于28 ℃恒温培养箱培养3 d，然后保存于4 ℃冰箱中；将菌株接种到种子培养基，于28 ℃、180 r/min摇床培养1 d，取500 μL种子培养基与500 μL 50%甘油充分混合，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.5 菌株生長曲线测定

于150 mL发酵培养基中接种筛选得到的纯菌株，培养开时测定OD600，以后每隔12 h取样1.5 mL测OD600，共测108 h，绘制菌株生长曲线。

1.6 酶活力测定

1.6.1 粗酶液制备。于150 mL发酵培养基中接种筛选得到的纯菌株，在28 ℃、220 r/min条件下摇瓶培养3～4 d。取发酵液，在5 000 r/min离心机中离心10 min，细胞胞外酶液存在于上层清液中（粗酶液）。

1.6.2 DNS法测定产纤维素酶菌酶活[7-8]。

（1）葡萄糖标准曲线绘制。用100 mL容量瓶定容配制1 mg/mL标准葡萄糖母液备用。将上述标准葡萄糖母液分别稀释成浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的葡萄糖溶液，各取2 mL。然后加入1 mL DNS试剂，沸水中煮沸8 min，冷却，补加21.5 mL蒸馏水，待溶液冷却至与室温一致后，分别用分光光度计测定吸光度值，波长为540 nm，记录吸光值，并绘制葡萄糖标准曲线。

（2）菌株羧甲基纤维素酶（CMC）活力测定[6，9]。在10.0 mL试管中加6.0 mL 1.0% CMC-Na溶液，再加不同培养时间的粗酶液2.0 mL，于50 ℃水浴锅中酶解30 min，再加2.0 mL DNS试剂，沸水浴8 min，取出试管放到事先准备好的碎冰中冷却至室温。然后加蒸馏水至10.0 mL，用分光光度计测定吸光值，波长为540 nm，根据绘制的葡萄糖标准曲线计算酶的活力值。

（3）菌株滤纸酶（FPA）活力测定[9-10]。取10.0 mL试管加入1 cm×6 cm新华1号滤纸，然后加入pH值为7.0的缓冲液6.0 mL，再加入不同培养时间的粗酶液2.0 mL，于50 ℃水浴锅中酶解30 min后，加2.0 mL DNS溶液，沸水浴8 min，将试管取出放入事先准备好的碎冰中冷却，直至室温，取出加蒸馏水至液面到达10.0 mL，置于分光光度计中测定吸光值，波长为540 nm，以绘制的葡萄糖标准曲线作为依据计算酶活力。

1.6.3 计算酶活力的方法。酶活力定义为：在50 ℃的温度下，1 mL酶液在1 min内水解底物生成1 μg葡萄糖所消耗酶量为1个酶活力单位，单位为U/mL。计算公式如下：

1个酶活力单位E=1 000×V×C/T×V1。

式中，T为水解时间（min）；V为定容体积（mL）；C为测试液中葡萄糖含量（mg/10 mL）；E为样品的酶活力（U/mL）；V1为吸取酶液的体积（mL）。

1.7 发酵条件的优化

1.7.1 氮源对产酶的影响。分别以蛋白胨、硫酸铵和尿素为单一氮源，将培养基置于200 r/min摇床培养，72 h后测定产酶活性。

1.7.2 碳源对产酶的影响。分别用羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、纸浆、麸皮、瞿麦作单一碳源，将培养基置于200 r/min摇床培养，72 h后测定产酶活性。

1.7.3 培养基pH值对产酶的影响。分别配制发酵培养基的pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，于30 ℃、200 r/min摇床培养，72 h后测定各组纤维素酶活性。

1.7.4 培养温度对产酶的影响。将斜面划线菌种接种于发酵培养基中，然后将培养基分别置于28、30、33、37、40 ℃温度条件下，200 r/min摇床培养72 h。培养结束后测定各组纤维素酶活性。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

从土壤中筛选得到数株产纤维素酶菌株，经过多次筛选操作以及纯化操作，测定透明圈直径记为H和菌落直径记为C，计算两者之比，最终选出酶活力较高的2株产纤维素酶菌株SKX-1、SKH-1，结果见表1。最后选择SKX-1菌株做后续试验。

2.2 菌株的鉴定

将SKX-1菌株进行PCR扩增，获得的特异性条带约为1.5 kb（图1）。把琼脂糖凝胶电泳中显示出条带的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序工作，经测序得到了1 444 bp片段。在NCBI上通过BLAST程序将上述PCR产物测序得到的序列与已知16S rRNA序列进行比对，比较所测序列与已知序列的同源性。结果显示，Genbank数据库中同源性相近的均为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus），相似性达到99%。

2.3 菌株生長曲线

根据比浊法绘制菌株SKX-1的生长曲线（图2），0～60 h处于延滞期，60～96 h处于指数期，96 h后进入稳定期。该曲线对后续菌株的发酵培养中确定菌种种龄有极大帮助，为后面的菌株发酵打下基础。

2.4 发酵条件的优化

由图3可以看出，SKX-1菌株以蛋白胨为氮源时，CMC、FPA酶活性最高；CMC以硫酸铵为氮源时酶活性次之；FPA以尿素为氮源时酶活性次之。

由图4可以看出，SKX-1菌株以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为碳源时，CMC、FPA酶活性最高；CMC以瞿麦为碳源时酶活性次之，FPA以麸皮为碳源时酶活性次之；纸浆为碳源时，CMC、FPA酶活性最低。

由图5可以看出，SKX-1菌株发酵培养pH值为7时，CMC、FPA酶活性最高。发酵液pH值5～9时，CMC酶活性为最高峰的80%以上；FPA酶活性偏碱和偏酸时酶活性很快降低。

由图6可以看出，菌株SKX-1在37℃发酵培养时，CMC和FPA都达到最高酶活性。SKX-1菌株在25～37 ℃发酵培养中，CMC、FPA酶活性呈现递增趋势；达到37 ℃，纤维素酶活性出现高峰；40 ℃酶活性下降。

3 结论与讨论

本试验从腐烂枯叶土壤中筛选出1株产纤维素的菌株，经16S rRNA鉴定为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。通过单因素试验确定氮源、碳源、pH值和温度对发酵液中CMC、FPA酶活力的影响；确定最优的发酵条件为：CMC-Na 10 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化钠5 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、自来水1 000 mL，温度37 ℃，pH值7。最优发酵条件下，200 r/min摇床培养72 h，CMC酶活力达到173.3 U/mL，FPA酶活力达到210.5 U/mL。该试验为菌株Bacillus cereus SKX-1的利用提供了理论基础。

产纤维素酶的菌株非常广泛，在真菌、放线菌、细菌上均有报道[11-12]，本研究又增添了1株产纤维素酶的菌株。1种分解纤维素的菌株难以在工业上实现将秸秆转化为可利用资源，但是菌株中互生现象大量存在，可以将产纤维素酶的菌株混合培养，观察纤维素的分解情况，混菌培养的方法有待进一步研究。若将混菌培养应用到实际生产中，将会对木材等含纤维素物质的分解以及环境保护具有重要意义[13]。

4 参考文献

[1] 陈丽燕，张光祥，黄春萍，等.两株高产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及酶学特性[J].微生物学通报，2011，38（4）：531-538.

[2] 王洪媛，范丙全.三株高效秸秆纤维素降解真菌的筛选及其降解效果[J].微生物学报，2010，50（7）：870-875.

[3] NOGAWA M，GOTO M，OKADA H，et al.L-Sorbose induces cellulase gene transcription in the cellulolytic fungus Trichoderma reesei[J].Current Genetics，2001，38（6）：329-334.

[4] 史央，蒋爱芹，藏传超.秸秆降解的微生物学机理研究及应用进展[J].微生物学杂志，2002，22（1）：47-50.

[5] 刘洁，李宪臻，高培基.纤维素酶测定方法评述[J].工业微生物，1994，24（4）：27-32.

[6] 钱林，郑巧利，付瑾，等.一株高效纤维素降解菌株的分离鉴定及其酶学性质[J].微生物学通报，2010，37（4）：524-528.

[7] 管斌，昉丁友，谢来苏，等.还原糖测定方法的规范[J].无锡轻工大学学报，1999，18（3）：74-79.

[8] 穆春雷，武晓森，李术娜，等.低温产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及纤维素酶学性质[J].微生物学通报，2013，40（7）：1193-1201.

[9] 朱军莉，韩剑众，励建荣.纤维素分解菌BSX5的分离、鉴定及产酶条件[J].食品与生物技术学报，2006，25（3）：15-18.

[10] 冯健玲，姚晓华，韦秉兴，等.稻草秸秆纤维素分解菌的分离筛选[J].基因组学与应用生物学，2009，28（3）：477-480.

[11] 黄艳，覃拥灵，凌敏，等.不同碳源诱导康氏木霉产纤维素酶的研究[J].中国酿造，2008，15（8）：41-44.

[12] SEWART B J，LEATHERWOOD J M.Derepressed synthesis of cellulase by cellulomonas[J].Journal of Bacteriology，1976，128（2）：609-615.

[13] CAMPBELL C J，LALLERRE？魨RE J H.The end of cheapoil[J].Scientific American，1998，278（3）：78-83.