呼吸机相关性肺炎患者下呼吸道标本检出的粘质沙雷菌β-内酰胺酶检测及同源性分析

陈晓香，许青霞，盛家和

(郑州大学附属肿瘤医院检验科，河南 郑州450000)

呼吸机相关性肺炎 (ventilator-associated pneumonia，VAP)是重症医学科(ICU)机械通气患者最常见的感染性疾病之一，可导致患者住院时间和ICU留治时间延长，抗菌药物使用增加，重症患者病死率增加[1]，因此遏制VAP已成为医疗机构需要迫切解决的问题[2]。目前，常引起呼吸机相关性肺炎的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等多有文献论述[1，3]，但粘质沙雷菌引起呼吸机相关性肺炎鲜有报道，故本文连续多年收集相关患者下呼吸道标本分离的粘质沙雷菌，研究其药物敏感性特征、主要β－内酰胺酶的基因型及是否存在粘质沙雷菌在患者之间的传播，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂 全自动细菌鉴定和药敏分析仪为美国BD公司PhoenixTM－100，PCR预混液、细菌DNA提取试剂盒、引物合成等来自上海生物工程技术有限公司，脉冲场凝胶电泳仪及凝胶成像系统购自美国Bio－Rad公司，PCR扩增仪购自美国ABI公司，E－test试纸条购自安图生物。

1．2 菌株来源及其鉴定和药敏 2015年3月1日至2017年3月1日，连续收集我院重症监护病房明确诊断为呼吸机相关性肺炎患者下呼吸道标本分离的粘质沙雷菌。下呼吸道标本的临床检验方法均严格参照《临床检验操作规程》[4]和《下呼吸道感染细菌培养操作指南》[5]。呼吸机相关性肺炎的诊断标准遵照 《中华医学会重症医学分会的诊疗指 南 》 和 规 范[1，6]。 质 控 菌 株 为 大 肠 埃 希 菌ATCC25922、沙门菌H9812。所有粘质沙雷菌的鉴定和最小抑菌浓度测定均使用PhoenixTM－100，并用E－TEST条验证，判读标准均参考CLSI2016年1 月 M100－S26[7]。

1．3 β－内酰胺酶基因型确证实验 试剂盒提取菌株基因组DNA为模板，引物及扩增条件均参考相关文献[8]，详见表1。其余β内酰胺酶基因blaTEM、blaSHV、blaFOX、blaOXA、blaCTX－M－2、blaCTX－M group 8/25、blaMOX、blaDHA、blaCMY1－23、blaACT－1和blaMIR等扩增条件、引物均参考文献[9]。如扩增阳性，产物直接纯化后测序，结果在GenBank上比对以确定基因型。

1．4 脉冲场凝胶电泳及指纹图谱聚类分析 菌株在LB肉汤中过夜震荡，菌液和2%的低熔点胶灌模，然后使用0．8g/L蛋白酶K消化24h，后使用TE洗胶及XbaⅠ37℃酶切过夜，并埋入1%琼脂糖凝胶电泳，切换时间为2．16－63．8s，电场强度是6V/cm，电场夹角是 120°，电泳时间是 18．5h，最后用溴化乙锭染色紫外灯成像，判读参考Tenover等人的标准[10]。

2 结果

2．1 菌株及药敏 共收集粘质沙雷菌67株。药敏结果显示，粘质沙雷菌对亚胺培南和美罗培南的敏感率均为100%，其次哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、复方新诺明等 的 敏 感 率 分 别 为 97．59% 、96．18% 、93．27% 、85．07%、82．13%，但对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、头孢呋辛、呋喃妥因等敏感率均低于50%。其中对头孢他啶和头孢噻肟耐药的10株粘质沙雷菌具体耐药谱见表2。

2．2 β－内酰胺酶表型和基因型确证实验 ESBLs表型实验证实，此10株粘质沙雷菌β－内酰胺酶表型均为阳性。扩增显示，在约561bp处均有清晰条带，测序比对的结果显示，均为CTX－M－14（详见图1），DNA 序列一致率均为 100%；1－5、7、10 在约895bp处有清晰条带，测序证实均为CMY－1（详见图2），DNA序列一致率均为100%。其余均为阴性。

图1 CTX-M-14基因PCR扩增电泳图（M为Marker）

表1 PCR扩增引物

表2 10株粘质沙雷菌的最小抑菌浓度（μg/ml）

2．3 同源性分析 菌株 1、2、5的条带的差异小于两条，表明此三株菌具有同源性，菌株3和4具有完全相同的条带，表明两株具有同源性，其余菌株均没有同源性（详见图3）。

图2 CMY-1基因PCR扩增电泳图（M为Marker）

图3 Xbal酶切后的脉冲场凝胶电泳图

3 讨论

粘质沙雷菌通常存在水和土壤中，被认为是院内感染的重要病原菌，可引起肺部、血流和泌尿系统感染等，严重的会引起院内感染的爆发，特别是在重症监护病房。从2015年3月1日至2017年3月1日，我院发生多起呼吸机相关性肺炎，其下呼吸道标本均分离出粘质沙雷菌。药敏情况统计表明，我院下呼吸道分离的粘质沙雷菌没有碳青霉烯类抗生素耐药株，对三代头孢菌素、氟喹诺酮类、氨基糖苷类等都具有较好的敏感率，优于2016年CHINET统计的数据[11]；但对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、头孢呋辛、呋喃妥因等耐药率较高，此与CHINET数据基本一致[11]。

β－内酰胺酶的检测表明，有10株粘质沙雷菌对头孢他啶和头孢噻肟耐药，均检出CTX－M－14型超广谱β－内酰胺酶。CTX－M是一种质粒介导的头孢菌素酶，包含多个快速增长的亚群，具有临床重要的意义[12]。CTX－M基因在世界各地的不同菌株均有检出，但不同地区流行的ESBLs的基因型或亚型有一定差异，如欧洲以CTX－M－1群为主，亚洲国家以 CTX－M－9 群为主[12，13]。 CTX－M－14 是CTX－M－9群的一种，在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌中均有检出。

除了CTX-M型超广谱β内酰胺酶外，还发现了有七株细菌同时产CMY-1型AmpC酶。CMY-1在国内极少有文献报道，仅国外有限的文献报道多在家禽和宠物分离的粘质沙雷菌CMY-1[14]，另有韩国的文献报道，367株粘质沙雷菌中，CMY-1的检出率为2.5%[15，16]，其他细菌包括肠杆菌科的细菌中，极少检出CMY-1。本文在临床标本中，连续在多株粘质沙雷菌中，发现CMY-1型AmpC酶基因，其基因周围序列的特征对于研究CMY-1基因的进化规律或重组过程有着重要的意义。

同源性分析的结果显示，菌株1、2和5具有典型的同源性。追踪其病历发现，此三株细菌均来自我院ICU病区三位不同的患者，均为2016年8月份入院，分别接受了膀胱肿瘤切除术、阴茎癌腹股沟淋巴结清扫术和直肠癌术后放疗后入住ICU病区，均为机械通气后48h出现体温升高，白细胞增多等现象，最高体温至39℃左右，WBC均在20.5×109/L以上，下呼吸道标本涂片低倍镜下每视野WBC大于25个，伴随大量的革兰阴性杆菌并吞噬，鉴定为粘质沙雷菌。菌株3和4为2016年5月份入院，均为多器官功能衰竭入住ICU病区，去除呼吸机后4-5h出现感染症状，下呼吸道标本也分离获得粘质沙雷菌。结果表明，同时产CMY-1和CTX-M-14的粘质沙雷菌1、2和5可能是我院传播的克隆株，而菌株3和4可能是我院传播的另一克隆株。追踪以上克隆株传播的路径有待进一步研究。

总之，通过本文的研究发现，我院引起呼吸机相关性肺炎的粘质沙雷菌对碳青霉烯类、氨基糖苷类和部分抗生素类仍保持较高的敏感性，但少部分菌株可通过携带CTX-M型超广谱β内酰胺酶或CMY-1型AmpC酶导致对三代头孢耐药；尤为重要的是，部分患者存在院内粘质沙雷菌克隆传播的可能，因此合理使用抗生素，做好院内多重耐药菌的防控极其重要。