梅毒血清固定患者外周血单核细胞中Toll样受体2-mRNA的表达及临床意义研究

李燕琼，张智敏

(1、驻马店市中心医院输血科，河南 驻马店463000；2、驻马店市中心医院检验科，河南 驻马店 463000)

梅毒血清固定[1]是指没有并发症的潜伏梅毒患者，经过正规驱梅治疗和2～3年的随访，非梅毒螺旋体血清学试验保持低度阳性，但梅毒抗体可以终身阳性。梅毒患者的年龄近年来呈现低龄化趋势，新发病例增加[2]，而非梅毒螺旋体抗体滴度数值下降至一定程度后即不再继续下降而长期维持在低滴度。对于梅毒血清固定的早期检测诊断，目前临床上主要使用患者清晨空腹血液进行超速离心后进行检测，临床诊断率不高且误诊严重[3]，本文采用近年来最新技术Toll样受体2mRNA（TLR2mRNA）对所需检测样本的外周血单核细胞诊断技术进行实验，以期得到预期效果。经过实验后结果证明，最新技术Toll样受体2mRNA（TLR2mRNA）对梅毒血清固定患者的外周血单核细胞有表达差异性，且对相关血清因子进行检测后效果显著，有实际的临床意义，且诊断率较高，现报道如下：

1 资料与方法

1．1 患者一般资料 选取 2016年5月－2017年 5月在我院门诊接受观察/随访的梅毒血清固定患者为观察对象。纳入标准：⑴年龄≥18周岁；⑵确诊为梅毒血清固定患者[4]；⑶无其他系统严重疾病者；排除标准：⑴临床资料不全者；⑵合并免疫功能障碍者。根据纳入排除标准共纳入研究对象80例，男 55 例，女 25 例，年龄 20～48 岁，平均 39．78±2．08 岁，病程 1～4 年，平均 2．75±0．63 年，其中病情程度为早期潜伏梅毒者50例，晚期潜伏梅毒者30例；病程≥2年者32例，＜2年者48例；对照组纳入排除标准：年龄≥18周岁，无严重疾病者，共纳入80例，男52例，女28例，年龄 21～49岁，平均39．80±2．13岁。两组的年龄和性别等一般资料比较无差别，具有可比性。

1．2 方法 对所需要进行实验的人群入院后在门诊立即完善相关检查后，对照组应在相同时期内在我院进行体检的健康成年人，观察组同期在我院接受随访的梅毒血清固定患者。在同时期相同的条件下对两组患者进行清晨空腹抽血化验，对比两组Toll样受体2mRNA在外周血单核细胞中的表达以及血清中相关因子的检测结果，同时还需比较梅毒血清固定患者之间不同临床分期间的2mRNA表达情况。

标本处理：取10mL枸椽酸钠抗凝静脉血，Ficoll法分离外周血PBMC，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞两遍后以调整细胞浓度约为 1．0×106/ml。PBMC悬液取 100μl，置于试管中再依次加入10μLFITC－抗 CD14 单克隆抗体和 10μLPE－抗TLR2单克隆抗体。FITC－mouseIgG2akappa10μL代替PE－抗TLR2单克隆抗体作为同型对照。充分震荡混匀后，置4℃条件下避光孵育30min，再利用上流式细胞仪检测CD14+细胞中TLR2的平均免疫荧光强度(meanfluorescenceintensity，MFI)及 TLR2+CD14+占CD14+细胞群的比例。

Toll样受体2mRNA检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附法，所需试剂购自苏州露水生物科技有限公司。操作步骤严格按照说明书进行。

1．3 评价指标 观察两组Toll样受体2mRNA在外周血单核细胞中的表达水平，比较不同临床特征梅毒患者外周血单核细胞中Toll样受体2mRNA表达情况。

1．4 统计学处理 采用SPSS 18．0软件进行统计分析。计数和计量资料分别例和均数±标准差表示。两组Toll样受体2mRNA在外周血单核细胞中表达的比较采用t检验进行统计分析，不同临床特征梅毒患者外周血单核细胞中Toll样受体2mRNA表达情况的比较采用t检验进行统计学处理。P＜0．05：差异有统计学意义。

2 结果

2．1 两组Toll样受体2mRNA在外周血单核细胞中的表达 梅毒血清固定患者外周血单核细胞中TLR2mRNA 表达水平低于对照组 （t=11．205，P＜0．001）。 见表 1。

表1 两组Toll样受体2mRNA在外周血单核细胞中的表达

2．2 不同临床特征梅毒患者外周血单核细胞中Toll样受体2mRNA表达的比较 病情程度为晚期潜伏梅毒、病程≥3年的梅毒血清固定患者外周血单核细胞中TLR2mRNA表达水平较低，且不同年龄、性别的患者外周血单核细胞中TLR2mRNA表达水平无明显差别。见表2。

表2 不同临床特征梅毒患者外周血单核细胞中Toll样受体2mRNA表达的比较

2．3 影响梅毒血清固定患者外周血单核细胞中TLR2mRNA表达水平的因素分析 将单因素分析有意义的病情程度和病程等因素作为自变量，以梅毒血清固定患者外周血单核细胞中TLR2mRNA表达水平作为因变量，进行多重逐步回归分析。结果病情程度进入回归方程，说明病情程度是影响梅毒血清固定患者外周血单核细胞中TLR2mRNA表达水平的因素。

3 讨论

梅毒患者病程一般分为两期，一期特指硬下疳阶段，是一个特别短暂的过程。二期则是出现了梅毒疹等，经过治疗消退，大部分的患者在早期潜伏梅毒（2年内）或者晚期潜伏梅毒（2年后）之间徘徊，针对此类患者的治疗需进行随访。梅毒血清固定患者一般均处于潜伏阶段[4]。在梅毒血清固定患者的外周血单核细胞中存在着Toll样受体2mRNA（TLR2mRNA）。

其中 Toll样受体 （Toll-likereceptors，TLR）是参与人体第一道防御系统的一类重要蛋白质分子之一，也是连接梅毒血清固定患者体液免疫和细胞免疫的重要受体[5]。Toll样受体可以识别来源于梅毒血清固定患者的外周血单核细胞中具有保守结构的分子[6]。当外周血单核细胞突破机体的物理屏障，Toll样受体可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答[7]。Toll样受体能结合梅毒血清固定患者的外周血单核细胞产生的一些内源性分子。免疫佐剂可增强梅毒血清固定患者的非螺旋抗体的染色识别[8]。

由于梅毒血清固定患者在发生发展过程中可以产生一些能被Toll样受体识别的非螺旋抗体内源性配体，所以本研究中Toll样受体在梅毒血清固定患者应答中发挥了一定作用[9]。在本研究中梅毒血清固定患者监测到2mRNA于Toll样受体，具有一定的特异性[10]，其中2mRNA是梅毒血清固定患者的非螺旋抗体，通过RNA复制生成新的RNA后再经rRNA进行蛋白质的翻译后生成mRNA，此过程形成于传递性RNA转录后[11]，在梅毒血清固定患者的外周血单核细胞中具有高度的基因表达性。因此在本研究中通过对梅毒血清固定患者的外周血单核细胞中的Toll样受体2mRNA的表达可以有效的检测[12]。

在本研究中需要对表达后血清中的相关因子进行检测即IL-6和TNF-α。IL-6是机体炎症因子之一，也是一种重要的内源性致热源[13]。IL-6的血清水平与梅毒血清固定患者中的非螺旋抗体所引起的滴度不变性有关[14]。TNF-α是一种基因多显性多肽调节因子，具有广泛的生物学活性，参与调节机体的免疫应答、细胞生长、分化等。有研究认为，TNF-α的改变可能与梅毒血清固定患者的外周血单核细胞中的Toll样受体2mRNA的表达有关[15]。

本研究中表1显示梅毒血清固定患者外周血单核细胞中的基因表达较低，说明这种基因表达与梅毒血清固定患者的非螺旋体抗体的滴度不变存在相关性。表2显示，梅毒血清固定患者的血清检测因子呈现率较低，说明在梅毒血清固定患者外周血单核细胞中的炎症因子成分存在低密度性以上两种表现形式均有助于诊断。表3显示梅毒血清固定患者分时期表达基因呈现多样性，说明对于Toll样受体的2mRNA表达存在时期的不均衡性，在确定时期内检测效果明显。表4显示Toll样受体的活性受到多种因素的影响，说明Toll样受体在梅毒血清固定患者外周血单核细胞中的基因表达中灵敏度高且特异性强。

综上所述，本研究应用梅毒血清固定患者外周血单核细胞中Toll样受体2mRNA （TLR2mR鄄NA）的表达能够对梅毒血清固定患者的检测效果得到确定且应用血清相关因子的检测使本研究效果更具有应用价值，安全可靠，检测效果使患者较为满意，值得临床推广应用。