红三叶根际溶磷菌株分泌有机酸与溶磷能力的相关性研究

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(1.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省草原技术推广总站，甘肃 兰州 730010)

土壤中的溶磷微生物可以通过不同的溶磷途径，间接为植物生长提供可溶性磷，进而有效促进作物生长[1]。Karlidag等[2]研究发现，将溶磷菌株BacillusM3、BacillusOSU-142混合施用，可以将苹果树土壤中的磷含量显著提高39.9%；Franco-Correa等[3]从三叶草根际土壤筛选出具有较强溶磷能力的链霉菌(Streptomyces)，能够显著促进三叶草植株的生长和氮素的固定；江红梅等[4]从向日葵(Helianthusannuus)根围土壤样品中筛选出的日本曲霉(Aspergillusjaponicus)，能将土壤难溶磷高效转化为有效磷，对水稻(Oryzasativa)生物量最大增加率达268.28%,玉米(Zeamays)盆栽实验结果显示对生物量的提高效果优于对照,花生(Arachishypogaea)经菌剂处理植株鲜重、干重分别增加43.92%和27.67%；Park等[5]发现，溶磷菌通过释放有机酸降低土壤pH值，同时固定铅污染土壤中的铅，可促进作物的生长；薛冬等[6]在牡丹(Paeoniasuffruticosa)根际分离得到的溶磷放线菌株PSPSA1在改善牡丹根际土壤磷素营养及开发微生物磷肥方面具有重要指导作用。此外，将具有溶磷特性的植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)菌肥施用于草莓(Fragaria×ananassa)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、青稞(Hordeumvulgare)和大蒜(Alliumsativum)中，均都取得了较好的应用效果[7-10]。目前很多研究表明，植物根际土壤中存在多种溶磷微生物，学者们对溶磷微生物溶磷机理研究的侧重点不尽相同，发现的溶磷微生物溶磷机理也各不相同[11-12]。分泌有机酸是溶磷微生物溶磷的主要途径之一，分泌的有机酸种类主要有：乙酸、丙二酸、草酸、乳酸、丁酸、丙酸、葡萄糖酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸等[13-16]，这几类有机酸分泌到土壤中会使土壤酸度增加，有效促进土壤中难溶性磷酸盐的转化和吸收，进而促进作物生长。赵小蓉等[17]从玉米根际和非根际土壤中分离得到74株溶磷微生物发现不同菌株分泌有机酸的数量和种类差异很大。王丹等[18]研究芽短梗霉F4产生的有机酸主要为草酸、柠檬酸和酒石酸，其中以草酸为主。Yi等[19]在研究过程中发现溶磷菌株产生的胞外多糖能够显著增强菌株的溶磷作用。有研究发现，分泌的有机酸既可降低培养基的pH，又能与钙、铁、铝等离子形成螯合物，从而使难溶性磷酸盐溶解[20]，也有人认为培养介质的pH降低并不是微生物溶磷的必要条件[21]。因此，本研究以岷山红三叶(Trifoliumpratense)根际分离筛选的4株优良溶磷菌进行液体培养，测定其溶磷量和分泌有机酸的种类及含量，分析溶磷量与发酵液pH、分泌有机酸种类、含量间的相关性，以期为红三叶根际溶磷菌株的溶磷代谢途径提供前期研究基础资料。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验区位于甘肃省定西市岷县岷山红三叶培育基地，属于典型的高寒阴湿区，适宜岷山红三叶生长，是我国岷山红三叶的主要培育区和种植区。海拔2493 m，年均降水量约为700 mm，无霜期112 d，年均气温5.8 ℃，年均日照2228.6 h。试验区土壤为亚高山草甸土，土壤pH为7.4～7.8，有机质含量11.8 g·kg-1，有效氮95.05 mg·kg-1，有效磷7.32 mg·kg-1，有效钾182.8 mg·kg-1。

1.2 材料

1.2.1供试菌株 2013年5和7月，分两次从岷山红三叶根际分离筛选出优良溶磷菌株[22](MHS7、MHS27、MHS30、MHS49)，菌株促生特性见表1。

表1 供试菌株的促生特性Table 1 Growth promoting characteristics of the tested strains

注：“-”表示抑菌率<5%，“*”表示未检测。

Note：“-” represents the inhibition rate was less than 5%, “*”represents no detected.

1.2.2培养基 1) LB培养基：蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，氯化钠 5.0 g，琼脂 20.0 g，加蒸馏水定容至1.0 L，调节pH为7.4。

2) 改良PKOC2培养基[22]：葡萄糖 18.19 g，磷酸钙 5.0 g，氯化镁 3.21 g，硫酸镁 0.25 g，氯化钾0.2 g，硫酸铵 0.08 g，加蒸馏水定容至1.0 L，调节pH至6.8～7.0。

1.3 菌株溶磷量和发酵液pH测定

在150 mL的三角瓶中加入50 mL改良PKOC2液体培养基，在121 ℃灭菌20 min，灭菌冷却后，将各待测菌株的菌悬液接种至三角瓶中，每个菌株设15个重复，以不接菌为对照。接种后将上述三角瓶置于28 ℃，160 r·min-1摇床上振荡培养13 d，分别在第5、7、9、11、13 d时，将培养液在4 ℃,8500 r·min-1离心10 min，取上清液，每次3个重复。采用钼锑抗比色法[22]测定菌液中有效磷增量(扣除对照组的有效磷增量)，用酸度计测定各溶磷菌株发酵液pH值。

1.4 溶磷菌株分泌有机酸种类及含量分析

1.4.1有机酸标品图谱 采用不同有机酸标准品(乳酸、草酸、丁二酸、苹果酸、富马酸、酒石酸)制备不同梯度有机酸标准品混合液，采用高效液相色谱仪(HPLC，Aglient 1260)进行测定分析，各有机酸保留时间、标准曲线方程、线性范围见表2。

表2 有机酸标准品色谱保留时间、标准曲线方程、线性范围Table 2 Retention time, standard curves equation and linear range of each organic acid

1.4.2溶磷菌株分泌有机酸含量测定 分别在5、7、9、11、13 d时，取上述各菌株离心后的上清液，将上清液用0.22 μm针头式滤器进行过滤。滤液采用HPLC测定有机酸种类和含量，每个菌株设15个重复，每次测定3个重复，进样量为20 μL。色谱条件：分离柱为C18柱(200 mm×4.6 mm)；洗脱缓冲溶液为(NH4)2HPO4。检测波长214 nm；洗脱流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃。

1.5 数据分析

采用SPSS 19.0软件对试验数据进行One-Way ANOVA分析和作图，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 菌株溶磷量与培养液pH间的关系

由图1可以看出，菌株MHS7培养过程中，培养液pH与溶磷量呈负相关(r=-0.3932，P=0.5125)，溶磷量在培养期内先逐渐升高，在第9天时溶磷量达到最大，后逐渐下降。菌株MHS27溶磷量在培养第7天时达到最大，后逐渐下降，pH与溶磷量间呈正相关(r=0.4252，P=0.4754)。菌株MHS30在5～13 d时溶磷量逐渐增大，到第13天时达到最高值269.5 μg·mL-1。随着溶磷量的增加，pH逐渐下降，其溶磷量与pH间呈显著负相关(r=-0.8827，P=0.0474)。菌株MHS49在培养5～11 d时，溶磷量和pH变化与菌株MHS30基本一致，与11～13 d的变化趋势相反。菌株MHS49的溶磷量与pH间呈负相关，但差异不显著(r=-0.8023，P=0.1024)。

图1 溶磷菌株培养期间溶磷量与pH动态变化Fig.1 Changes of phosphorus-dissolving capability and pH of strains during culture period

2.2 菌株溶磷能力与分泌有机酸的关系

2.2.1溶磷菌株分泌有机酸种类及含量测定 采用HPLC法在溶磷菌株培养第5、7、9、11、13天，测定各菌株培养液中的有机酸种类及含量。从表3可以看出，菌株MHS27、MHS7、MHS49的培养液中未检测到酒石酸，其他种类的有机酸均能够检测到，包括乳酸、草酸、丁二酸、苹果酸、富马酸。各菌株培养液中，检测到的有机酸种类和含量存在明显差异。菌株MHS27分泌乳酸的能力最强，是其他菌株的1.16～3.10倍，该菌株分泌草酸和苹果酸的能力相对较高，分泌丁二酸的能力较差。菌株MHS30分泌乳酸能力是其他溶磷菌株的1.2～2.0倍，此外，该菌株分泌富马酸、丁二酸的能力也是所有溶磷菌株中最好的。菌株MHS7分泌苹果酸的能力最好，分泌其他有机酸的能力处于中上等水平。菌株MHS49产草酸的能力最强，分泌苹果酸、丁二酸的能力相对较好，分泌其他有机酸的能力较差。由此可见，上述4种高效溶磷菌株分泌有机酸的种类和含量差异很大，但分泌有机酸的含量与溶磷菌株溶磷量之间是否存在相关性，需进一步分析。

表3 培养期间溶磷菌株分泌有机酸含量Table 3 Content of organic acid produced by phosphorus solubilizing strains (mmol·L-1)

注：表中数据为平均数±标准误。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。

Note: Data are mean±SE. Different letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test.

图2 培养期间溶磷菌株有机酸总量 Fig.2 Total organic acids content for strains during culture period

2.2.2溶磷菌株培养液有机酸总量动态变化 4株溶磷菌株培养期间(0～13 d)分泌有机酸总量变化情况见图2。各溶磷菌株中，分泌有机酸总量较大的是MHS7、MHS27。菌株MHS49和MHS7分泌有机酸的变化趋势较为接近，在培养0～11 d时，有机酸总量逐渐增加，在第11天时，分泌有机酸总量达到最大，后逐渐减少。菌株MHS30分泌有机酸总量在培养期间，逐步呈增加的趋势。菌株MHS27分泌有机酸总量在0～9 d时，呈先增加后降低的趋势，在9～13 d时，又呈先增加后降低的趋势。

2.2.3溶磷量与有机酸含量的相关性 为明确各溶磷菌株的溶磷途径，比较分析了各菌株溶磷量与有机酸含量间的相关性(表4)。各菌株培养液中不同有机酸含量与菌株溶磷量之间的相关性差异很大。菌株MHS30分泌有机酸总量与溶磷量间呈极显著正相关(r=0.9825，P<0.01)。其余各菌株分泌有机酸总量与溶磷量间差异不显著。菌株MHS49溶磷量与分泌乳酸、富马酸间呈负相关(P>0.05)；与分泌丁二酸呈显著正相关(r=0.9347，P<0.05)。菌株MHS27溶磷量与分泌苹果酸、富马酸含量间呈负相关(P>0.05)；与分泌乳酸之间呈显著正相关(r=0.9256，P<0.05)。菌株MHS30溶磷量与分泌酒石酸呈显著正相关(r=0.9514，P<0.05)。菌株MHS7溶磷量与分泌有机酸含量均不显著。由此可见，不同溶磷菌株溶磷能力的大小与其分泌的有机酸种类和含量之间的相互关系存在多样性，不同溶磷菌株存在不同的溶磷途径。

表4 菌株溶磷量与有机酸含量间相关分析Table 4 Pearson correlation for P solubilization and organic acid content of strain

注：“*”表示在0.05水平上差异显著，“**”表示在0.01水平上差异显著。

Note: “*” indicates a significant difference at the 0.05 level, and “**” indicates a significant difference at the 0.01 level.

3 讨论

植物根际土壤中存在多种溶磷微生物，不同溶磷微生物的溶磷途径存在多样性[11-16,20-21,23]。其中，最常见的溶磷机制是溶磷微生物通过分泌有机酸类物质来溶解难溶性磷。有研究发现，溶磷微生物溶解无机磷是由于溶磷微生物在生长过程中产生各种有机酸，有机酸在降低培养液pH的同时，能够与培养液中Fe3+、Ca2+、Mg2+等离子发生螯合，进而使难溶性磷酸盐转化为可溶性磷[24-25]。本研究发现，岷山红三叶根际分离获得的4株高效溶磷菌在培养期间可以分泌草酸、乳酸、苹果酸、富马酸、酒石酸、丁二酸，并且各菌株分泌的有机酸种类和含量各不相同。菌株MHS30培养期间可以分泌大量有机酸，该菌株溶磷量与分泌的有机酸总量显著正相关(P<0.01)，与培养期间菌液的pH值显著负相关(P<0.01)。这说明菌株MHS30可能在培养期间不断分泌有机酸类物质，提高了培养环境的酸度，使难溶性磷在酸性条件下发生溶解。也有可能是分泌出的有机酸通过羟基或羧基与磷酸钙中的Ca2+，Mg2+，Al3+等金属离子发生螯合作用，从而将磷酸钙中的PO43-释放出来，这与其他研究结果相近[26-28]。就菌株MHS30而言，有效磷增量与分泌的有机酸总量、菌液pH间存在显著相关性，但微生物的溶磷机理非常复杂，溶磷量并不完全由分泌的有机酸总量决定，是由于多种因素共同作用的结果[13]。

分泌有机酸是溶磷微生物溶磷的重要途径之一，但并不是溶磷微生物溶磷的唯一途径，菌株MHS27也可以分泌有机酸，但是其溶磷量与有机酸含量之间并没有显著的相关性，可能存在其他溶磷途径。有研究发现溶磷微生物还可以通过释放H+来溶解无机磷酸盐，但是该途径中的H+并不是微生物产酸得到的。有些溶磷微生物虽产酸能力很差，但具有一定的溶磷能力，这很有可能与释放质子(H+)的溶磷途径有关[29]。本研究发现，菌株MHS49产酸能力较差，但是可以溶解磷酸钙。这可能是该菌株在培养过程中通过呼吸作用产生了H2CO3，由H2CO3释放出的H+发挥了溶磷作用，也有可能是该溶磷细菌在代谢过程中吸收了NH4+从而释放出H+，进而产生溶磷作用[30-31]。MHS7的溶磷量不但与分泌的总有机酸之间没有相关性，且培养液pH与溶磷量呈负相关(P>0.05)，说明MHS7在培养过程中起溶磷效果的既不是分泌的有机酸的影响，也不是pH的改变。毕江涛等[32]研究发现，微生物可以通过分泌核酸酶、植酸酶和磷酸酶等物质将难溶性磷酸盐转化为植物可吸收利用的可溶性磷酸盐，Titball[33]认为微生物降解有机磷或矿物磷等非可溶性磷盐的能力决定于胞内磷水平并受胞外有效磷浓度的影响。可见分泌有机酸和pH的改变不是它的溶磷途径，今后可进一步探讨其详细的溶磷机理。

本研究中有些菌株分泌有机酸在培养期间未检测到或有机酸含量变化差异较大，可能是某时期菌株分泌有机酸被其他代谢物限制或所受调控基因表达差异有关。李小冬等[34]采用转录组学解析了白三叶(Trifoliumrepens)根际溶磷菌株RW8的溶磷机制，研究发现，以可溶磷为对照，在难溶磷条件下，分别检测到4782个基因在RW8中上调表达，447个基因下调表达；在无磷组中，共检测到3630个基因上调表达，209个基因下调表达。生物学过程主要聚类在代谢过程、细胞过程、单细胞过程、刺激应答、定位以及生物反应调节；细胞组分主要聚类在细胞组分、细胞膜、膜组分与高分子配合体等；分子功能主要聚类在催化活性、结合功能与转运功能，这说明了溶磷微生物的溶磷过程非常复杂，而不是一个单一生物学过程。因此，本研究中4株溶磷菌株的分子生物学溶磷机制需进一步研究。

4 结论

菌株MHS7、MHS27、MHS30和MHS49均能分泌乳酸、草酸、苹果酸、富马酸和丁二酸，其中菌株MHS30还能够分泌酒石酸；菌株MHS7和MHS27溶磷量与pH呈正相关(P>0.05)，与分泌乳酸量呈显著正相关(P<0.05)；菌株MHS30溶磷量与pH呈显著负相关(P<0.05)，与分泌有机酸总量呈极显著正相关(P<0.01)，与分泌酒石酸呈显著正相关(P<0.05)；菌株MHS49溶磷量与分泌丁二酸呈显著正相关(P<0.05)；各菌株间分泌有机酸的种类和数量差异较大，溶磷菌的溶磷量与总有机酸量间存在一定相关性，不同菌株溶磷能力与其分泌的有机酸种类和含量间的关系复杂，不同菌株的溶磷途径存在差异。