基于60个核心SSR标记的糯玉米自交系遗传多样性分析

赵文明，王 森，陈艳萍，张美景，袁建华

(江苏省农业科学院 粮食作物研究所，江苏 南京 210014)

鲜食糯玉米因其营养丰富，风味独特，适口性好而成为农产品新宠，深受消费者青睐，市场需求激增，种植面积逐年扩大。近年来，江苏省糯玉米年种植面积达10万hm2以上，已发展成为高效农业重要组成部分，促进了农民增收、农业增效和农村发展。江苏是国内较早开展糯玉米育种研究的单位，拥有丰富的糯玉米种质资源。研究江苏糯玉米种质和其他地区糯玉米种质的遗传多样性与亲缘关系，对于促进其他地区种质在江苏糯玉米育种中的利用、拓宽江苏糯玉米种质资源具有重要意义。糯玉米种质多来源于农家品种和杂交种，多数自交系亲缘关系不清楚。SSR标记具有多态性高、稳定性好、共显性、操作简单等优点，已广泛应用于糯玉米自交系遗传多样性的研究[1-12]。北京市农林科学院玉米研究中心设计了一套适于中国玉米种质资源、尤其是自交系研究的核心标记，包括40个核心SSR标记和20个候选核心SSR标记[13]。这些标记具有良好的稳定性与极高的多态性，一直用于中国玉米品种一致性鉴定以及中国玉米自交系与杂交种指纹图谱的构建[14-16]。目前，利用这些核心SSR标记对糯玉米自交系的遗传多样性的研究相对较少。本研究利用60个核心SSR标记分析68份糯玉米自交系的遗传差异及亲缘关系，旨在为江苏糯玉米种质的改良和利用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为68份糯玉米自交系(见表1)。Tris、NaCl、EDTA、β-巯基乙醇、丙烯酰胺、N,N′-亚甲双丙烯酰胺、尿素、硼酸、无水乙醇、硝酸银、10 PCR×Buffer(含MgCl2)、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)、dNTP购自生工生物工程(上海)股份有限公司。NanoDrop 2000C超微量分光光度计购自美国Thermo Fisher公司，PCR仪购自中国Long Gene公司，DYCZ-20C垂直电泳槽购自北京六一生物科技有限公司。

表1 68份糯玉米自交系名称及地理来源

1.2试验方法

1.2.1 DNA提取与检测 供试材料于幼苗长至4片叶时，取新鲜叶片冷冻干燥后在自动磨样机上研磨，采用改良的CTAB法提取基因组总DNA，利用NanoDrop 2000C超微量分光光度计检测DNA浓度和质量。采用灭菌超纯水将DNA样品浓度稀释至50 ng/μL，放在-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 引物设计及合成 根据文献Development and characterization of a core set of SSR markers for fingerprinting analysis of Chinese maize varieties[13]公布的60个核心SSR标记的名称、序列等信息(见表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增与产物检测 PCR扩增反应在Long Gene公司的MG96G型PCR仪上进行。PCR反应总体系10 μL。其中，10 PCR×Buffer(含MgCl2) 2 μL、2 mmol/L dNTP 0.2 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.1 μL、DNA 模板(25 ng/μL) 1 μL、引物 1 μL、ddH2O 5.7 μL。PCR反应过程为94 ℃预变性5 min，1个循环；94 ℃预变性40 s，60 ℃复性35 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后于72 ℃延伸10 min。PCR 扩增完成后，PCR产物利用6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳检测，以东盛生物M1041作为DNA分子量标记。电泳完毕后，硝酸银染色，照相。

表2 60个核心SSR标记的基本信息

续表2：

1.3 数据分析

利用Power-Marker V3.25软件计算60个SSR标记在所有自交系上的等位变异数、基因多样性(Gene diversity)和多态信息含量(polymorphism information content，PIC)。采用Nei′s 1973算法计算自交系间遗传距离(GD)，利用GD值按UPGMA进行遗传相似性聚类分析。

2 结果与分析

2.1 SSR标记的多态性分析

60个核心SSR标记在68份糯玉米自交系中扩增到414个等位变异，每个标记检测出的等位变异数为3～13个，平均为6.9个。在这些标记中，等位变异最多的是bnlg1191k7，检测出13个；最少的则是umc1432y6，检测出3个。60个标记的多态性信息量(PIC)介于0.4630～0.8515之间，平均为0.7144。在这些标记中，bnlg2235y5的PIC最低，为0.4630；bnlg1191k7的PIC最高，为0.8515；11个标记的 PIC>0.8。68份糯玉米自交系的基因多样性变幅为0.4982～0.9124，平均为0.7603。60个核心标记所揭示的基因多样性差异较大，其中，bnlg2235y5、umc1705w1、umc1432y6揭示的基因多样性低于0.6，49个标记则超过0.7，有15个超过0.9 (见表3)。

2.2 供试材料的聚类分析

群体内个体间亲缘关系的远近通常由遗传距离的大小来反映。群体内个体间遗传距离小，说明亲缘关系近，遗传多样性低；遗传距离大，说明亲缘关系远，遗传多样性高。采用Nei′s 1973算法计算68个糯玉米自交系间遗传距离(GD)。68个糯玉米自交系的遗传距离，变幅为0.1800～0.9600，平均为0.7402。68份自交系的遗传距离分析表明，89.79%的自交系间遗传距离分布在0.6100～0.9600之间，说明供试材料间的遗传距离较大，亲缘关系较远。其中，25.23%的遗传距离分布在0.8100～0.9600之间，说明这些成对自交系之间的亲缘关系较弱。10.21%的自交系间遗传距离分布在0.1800～0.6000之间，表明这些自交系之间有不同程度的亲缘关系。0.75%的自交系间遗传距离分布在0.1800～0.4000之间，说明这些成对自交系间有很大的亲缘相关性。68份自交系之间，靖黑糯001与JDN003的遗传距离最大，为0.9600；DN830与LBN2586、QW85与LBN2586、QW85与衡白522之间的遗传距离次之，为0.9400，说明这4对自交系间的亲缘关系最远。JSW0388与JSW6238的遗传距离最小，为0.1800；JSW10684与JSW10722、T361与通系5的遗传距离次之，为0.2200，说明这3对自交系之间亲缘关系最近。此结果与自交系的来源基本一致，也表明68份糯玉米自交系有广泛的遗传基础，遗传多样性丰富(见图1)。

表3 60个核心SSR标记的遗传多样性统计

续表3：

2.3 供试材料的聚类分析

根据68份糯玉米自交系在60个核心SSR标记的基因型数据，运用Power Marker V3．25 软件，采用Nei′s 1973 算法计算自交系之间的遗传距离，构建UPGMA聚类图，进行聚类分析。聚类分析结果表明，68份自交系被划分为5大类群(见图2、表4)。第一类群以JS0381为代表，包括11个自交系，称为JS0381类群；第二类群以衡白522为代表，包括15个自交系，称为衡白522类群；第三类群以西南地区优良糯玉米自交系S181为代表，包括9个自交系，称为S181类群；第四类群以通系5为代表，包括19个自交系，称为通系5类群；第五类群包括14个自交系，这些自交系地理来源广泛，未能明确地划分到其他4个类群，称为中间类群。将类群划分结果与自交系系谱来源进行对比分析，发现聚类分析结果与自交系来源基本一致(见表5)。此结果表明，60个核心SSR标记可用于糯玉米自交系类群划分。通过聚类分析和遗传距离分析，可以将一些来源不清晰的糯玉米自交系划分至不同的类群中，明确了与其它自交系间的亲缘关系，可提高其利用效率。

图1 68份糯玉米自交系之间的遗传距离(GD)分布

图2 基于SSR标记的68份糯玉米自交系UPGMA聚类图

2.4 江苏糯玉米杂种优势模式分析

合理准确地划分玉米自交系杂种优势群，建立相应的杂优模式，才能有效地改良自交系和选配杂交组合，提高育种效率和水平。糯玉米自交系杂种优势群的划分和杂种优势利用模式的建立，有利于糯玉米育种水平的提高和发展[17]。本研究聚类分析结果表明，江苏糯玉米自交系主要是通系5和衡白522的衍生系，划分为通系5 类群和衡白522 类群；以此为基础组配杂交组合，育成了苏玉糯1号、苏玉糯2号、苏玉糯639、苏玉糯901、江南花糯、苏科花糯2008、苏科糯3号、苏科糯4号、苏科糯5号、苏科糯9号、苏科糯1505，形成了通系5 类群×衡白522 类群的杂种优势利用模式。江苏省农业科学院粮食作物研究所以糯玉米杂交种中糯1号和FP0702为基础材料，育成了糯玉米自交系JS0381、JS04388、JS0388、JSW10721、JSW1166，形成了JS0381类群；以糯玉米杂交种黔糯968和国家玉米产业技术体系交换材料WX004为基础材料，育成了糯玉米自交系JSW15180和JSW15227，划分到S181类群。JS0381、JS04388、JS0388、JSW10721与JS0382、JS09116、JSW10722和JSW10684组配杂交组合，育成了苏科糯2号、苏科糯6号、苏科糯8号、明玉1203，形成了JS0381类群×通系5类群的杂种优势利用模式；JSW1166与WX004、JSW15227组配杂交组合，育成了苏科糯10号、苏科糯1703，形成了JS0381类群×S181类群的杂种优势利用模式；JS0581、JSW12471与JSW15180组配杂交组合，育成了苏科糯1704、苏科糯1701，形成了衡白522类群×S181类群的杂种优势利用模式(见表5)。本研究表明，通系5 类群×衡白522 类群仍是江苏糯玉米育种主要的杂种优势模式；引进的新种质已逐步在江苏糯玉米育种中得到应用，拓宽了江苏糯玉米种质的遗传基础，形成了JS0381类群×通系5类群、JS0381类群×S181类群、衡白522类群×S181类群的杂种优势模式。尽管这些新种质及其杂种优势模式目前尚未在江苏糯玉米育种中占主导地位，但其具有较为丰富的遗传多样性及存在许多优异种质资源，这将是江苏未来糯玉米育种取得突破的关键。

表4 68份糯玉米自交系类群划分明细

3 结论与讨论

3.1 糯玉米自交系的遗传多样性

本研究结果表明，基于60个核心SSR标记所揭示的68份糯玉米自交系的平均等位变异为6.9个，基因多样性为0.7603，多态性信息量为0.7144，高于前人基于普通SSR标记对糯玉米自交系遗传多样性的分析结果[2-12]。这可能与本研究所用自交系的来源广泛和SSR标记的多态性较高有关。

3.2糯玉米自交系的类群划分

利用聚类分析将不同来源的糯玉米种质进行分类，明确其亲缘关系，可为糯玉米种质的改良和优质高产组合的组配提供参考依据。在糯玉米自交系类群划分研究上，前人做了较多研究。受标记数量多少、研究材料来源及数量、标准测验种等因素的影响，不同报道在类群个数、类群名称的确定上存在一定的差异[3-12,18]。北京市农林科学院玉米研究中心以糯玉米杂交种中糯1号为基础材料，育成了自交系京糯6，形成了京糯6类群；以糯玉米杂交种紫糯3号为基础材料，育成了自交系BN2，划分到Reid类群[18]。本研究中，江苏省农业科学院粮食作物研究所以糯玉米杂交种中糯1号为基础材料，育成了自交系JS0381、JS04388、JS0388，形成了JS0381类群；京糯6与JS0381类群自交系聚类在一起，BN2与衡白522类群自交系聚类在一起。本研究利用60个核心SSR标记，通过UPGMA 聚类分析，将68份自交系划分为5个类群，划分结果与自交系来源基本一致，与前人报道也表现出了一定的一致性，说明核心SSR标记可用于糯玉米自交系遗传多样性分析及类群划分，并能取得良好效果。

3.3 糯玉米杂种优势利用模式

玉米育种研究的关键在于合理准确地划分杂种优势群和建立杂种优势利用模式。沈锦根等[17]研究认为通系5类群和衡白522类群为江苏糯玉米主要杂种优势群，通系5类群×衡白522类群是主要杂优模式。史亚兴等[18]研究认为京糯6群×Reid群是我国糯玉米品种选育的主要杂优模式。张胜恒等[19]研究认为S181类群、衡白522类群为重庆糯玉米育种主要杂优类群，S181类群×衡白522类群为主要杂优模式。本研究表明，通系5类群×衡白522类群仍是江苏糯玉米育种主要的杂种优势模式，已形成了JS0381类群×通系5 类群、JS0381类群×S181类群、衡白522类群×S181类群的杂种优势模式。一些来源不清晰的糯玉米自交系被划分至不同类群中，依据此结果进行糯玉米杂交种组配，可以避免盲目测配，提高利用效率。糯玉米育种工作中，不仅要考虑杂种优势，还要考虑品质性状、抗病性、抗虫性、抗逆性等，培育优质、高产、广适的品种。

表5 江苏省育成的部分糯玉米品种亲本自交系系谱来源

60个核心SSR标记适用于糯玉米自交系的遗传多样性分析及亲缘关系研究，类群划分结果基本符合自交系的来源情况。68份糯玉米自交系的遗传多样性相对丰富，亲缘关系较远，作为糯玉米种质资源利用及品种选育具有一定的价值。