DOLPA/AOT-异辛烷反胶束萃取-UPLC法测定倒提壶中4种生物碱的含量

樊轻亚，王万好，代春美

(1.信阳职业技术学院，河南 信阳 464000;2.河南同源制药有限公司，河南 信阳 464000;3.中国中医科学院，北京 100700)

倒提壶(CynoglossumamabileStapfetDrumm)是紫草科琉璃草属植物，分布于不丹及中国的西藏、云南等地。倒提壶全草入药，其味苦，性凉，有清热利湿、散瘀止血、止咳、镇痛之功效，常用于治疗疟疾、肝炎、痢疾、咳嗽、风湿性关节炎、尿道炎等[1-3]。倒提壶的主要成分为生物碱，如天芥菜碱、毛果天芥菜碱、天芥菜品和天芥菜定等[4-8]，这些生物碱具有广泛的药理和毒理活性，如抗肿瘤、抗菌、抑制微生物及肝毒性等，因此研究倒提壶的生物碱成分具有重要的临床应用价值。

反胶束萃取技术是20世纪80年代初发展的分离、纯化技术，具有萃取环境温和、选择性高、不改变样品生物活性、极少使用有机溶剂等优点，广泛应用于蛋白质、酶、氨基酸等生物大分子的分离纯化中。近年来开始应用于中药有效成分的萃取分离方面，并显示了良好的应用前景[9-13]。本文首次将反胶束萃取技术用于倒提壶中有效成分的分离，获得二(2-乙基己基)磷酸酯(DOLPA)/ 二(2-乙基己基)丁二酸酯磺酸钠(AOT)-异辛烷反胶束萃取倒提壶生物碱的最佳工艺条件。超高效液相色谱法(UPLC)具有方法简便、分析时间短和溶剂消耗少等特点，尤其适用于中药材中多指标成分的定量检测[14-16]。本文采用 UPLC技术，建立了测定倒提壶中天芥菜品、天芥菜碱、毛果天芥菜碱和天芥菜定含量的方法，可为倒提壶制剂的开发及质量控制提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

DFY-200摇摆式高速中药粉碎机(温岭市大德中药机械有限公司)；B-260型恒温水浴(上海雅荣生化设备仪器有限公司)；美国 Waters 超高效液相色谱 Accuricy(UPLC)系统，包括二元超高压溶剂系统(BSM)、二极管阵列检测器(PDA)。

天芥菜品(111810-201512，纯度>98%)、天芥菜碱(111830-201512，纯度>98%)、毛果天芥菜碱(111920-201510，纯度>98%)、天芥菜定(111520-201511，纯度>98%)购于成都普菲德生物技术有限公司；二(2-乙基己基)丁二酸酯磺酸钠(AOT)、二(2-乙基己基)磷酸酯(DOLPA)、三乙胺、氨水、95%乙醇、盐酸、氯仿(分析纯，郑州德众化学试剂厂)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Merck 公司)；实验用水为蒸馏水；倒提壶(广西玉林药材市场)经信阳职业技术学院药学院聂新奇院长鉴定为倒提壶(CynoglossumamabileStapfetDrumm)全草。

1.2 实验方法

1.2.1乙醇回流法提取生物碱称取一定量粉碎过100目筛的倒提壶药材，加4倍量的95%乙醇回流3次，每次1.5 h，过滤，合并滤液后浓缩，备用。

1.2.2反胶束溶液的配制称取一定量的DOLPA和AOT(质量比1∶1)置于250 mL烧杯中，加入适量异辛烷，在磁力搅拌器上搅拌使其完全溶解，得到透明澄清的反胶束溶液。

1.2.3反胶束法萃取提取液取按“1.2.1”方法提取的倒提壶生物碱粗提液浸膏，用盐酸或氢氧化钠分别调节水相的 pH 值为4.0。以 KCl调节水相的离子强度，使水相中 KCl 的浓度为 0.2 mol/L，加入粗提液4倍体积的DOLPA/AOT-异辛烷反胶束溶液，室温下电磁搅拌萃取10 min，取上清液，转入分液漏斗静置分层，取上层有机相转移至一小锥形瓶中，加入等体积的水后，室温下电磁搅拌反萃取 30 min；转入分液漏斗静置分层，取下层水相待测。

1.2.4溶剂法萃取提取液取按“1.2.1”方法提取的倒提壶生物碱粗提液浸膏，用30 mL稀盐酸超声溶解，倾出上清液，置于分液漏斗，用氯仿萃取，萃取后的水相用1% NaOH溶液调至pH 10.0，再用氯仿萃取3次，收集氯仿层，旋干，用甲醇溶解、定容，待测。

1.2.5UPLC测定条件色谱柱为Waters BET C18( 2.1 mm×150 mm，1.7 μm) ，流动相为乙腈(A)-0.2%三乙胺水溶液(B)，梯度洗脱程序:0～1 min，5% A；1～7 min，5%～10% A;7～12 min，10%～15%A;12～16 min，15%～25% A；检测波长254 nm，流速0.25 mL/min，柱温45 ℃，进样量1 μL。

1.2.6对照品溶液的制备精密称取对照品天芥菜品6.0 mg、天芥菜碱12.0 mg、毛果天芥菜碱9.0 mg、天芥菜定4.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即得混合对照品溶液。

图1 反胶束体系对4种生物碱萃取率的影响Fig.1 Effects of different reverse micelles on extraction efficiencies of four alkaloids1.heliosupine, 2.heliotrine, 3.lasiocarpine, 4.heliotridine

2 结果与讨论

2.1 反胶束体系的筛选及萃取条件的优化

2.1.1表面活性剂种类及浓度的影响根据近年来的相关报道及本实验室的相关研究成果[6-8]，在用离子表面活性剂形成的反胶束进行萃取时，反胶束萃取的最主要推动力是正负电荷间的静电吸引。表面活性剂和被萃取物所带的异性电荷数量越多，静电吸引作用越强，越容易被带相反电荷的反胶束萃取。4种生物碱在酸性条件下与 H+结合而带正电荷，因此阴离子表面活性剂形成的反胶束更适于萃取碱性物质。本实验考察了AOT、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、十二烷基硫酸钠(SLS)、DOLPA 5种表面活性剂形成的反胶束体系的萃取效果，结果显示,SDBS、SDS、SLS形成的反胶束体系不稳定，而DOLPA和AOT均可形成均一、稳定透明的反胶束体系。进一步考察了DOLPA-异辛烷、AOT-异辛烷、DOLPA/AOT-异辛烷反胶束体系对萃取结果的影响(图1)。结果显示，DOLPA/AOT-异辛烷混合反胶束体系对倒提壶生物碱的萃取性能最好。其原因可能是由于DOLPA 和AOT分子均为双链结构，其极性基团较小，两者混合后反胶束体系中的胶束由圆形过渡到棒状结构，这种棒状胶束对胶束内核的被增溶物具有较大的溶解能力，有利于分子较大的生物碱进入。因此实验选择DOLPA/AOT-异辛烷体系作为最佳反胶束体系。

进一步考察了DOLPA/AOT总浓度在0～1.0 mol/L范围内对4种生物碱萃取率的影响。结果显示，随着DOLPA/AOT浓度的增大，4种生物碱的萃取率呈先增大后减小的趋势。这是因为随着DOLPA/AOT 浓度的增大，有机相中的反胶束数量增多，使得萃取率增加，但当DOLPA/AOT浓度增至 0.6 mol/L时，其在异辛烷中的溶解度达到饱和，继续增加DOLPA/AOT的浓度，表面活性剂开始团聚，反胶束体系粘度变大，从而增加了萃取过程中的传质阻力，导致萃取率降低。因此实验选择DOLPA/AOT的最佳浓度为0.6 mol/L。

图2 水相pH值对4种生物碱萃取率的影响Fig.2 Effects of pH value on extraction efficiencies of four alkaloids1.heliosupine, 2.heliotrine, 3.lasiocarpine, 4.heliotridine

图3 盐种类对4种生物碱萃取率的影响Fig.3 Effects of different salts on extraction efficiencies of four alkaloids1.heliosupine, 2.heliotrine, 3.lasiocarpine, 4.heliotridine

2.1.2水相pH值的影响考察了不同水相pH值对4种生物碱萃取率的影响，以稀HCl和稀NaOH调节水相pH 值为 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，分别进行反胶束萃取(图2)。由图可知，生物碱的萃取率最初随着水相pH值的升高而增加，且在pH 4.0时萃取率达最大；当pH>4.0 时，生物碱的萃取率降低；pH 12.0时的萃取率几乎为0，这是由于随着 pH值的增大(pH>8.0)，带正电荷的生物碱离子减少，生物碱主要以游离分子存在，则与DOLPA/AOT 的静电引力逐渐减弱，导致萃取率降低。因此选择最佳pH值为4.0。

2.1.3水相盐种类与浓度的影响反胶束萃取过程中向水相加盐后，会影响表面活性剂的解离以及反胶束中内表面的电荷密度，从而影响反胶束的萃取效果，因此考察了水相中KCl、CaCl2、BaCl2对4种生物碱萃取率的影响(图3)。由图可知KCl的萃取效率最高，这是因为在阴离子相同的情况下，盐对DOLPA/AOT反胶束萃取的影响主要来自阳离子，且阳离子所带电荷越少萃取效果越好，因此KCl的效果最好。

考察了KCl浓度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L)对生物碱萃取率的影响。 结果显示，萃取率随KCl浓度的增大而增加，当KCl浓度为 0.2 mol/L时，萃取率达最大。此后继续增大KCl浓度，生物碱的萃取率反而明显下降，原因可能是离子浓度越大，离子对反胶束双电层的压缩越严重，对生物碱及DOLPA/AOT静电吸引的屏蔽过强，导致萃取剂对生物碱的加溶能力急剧下降，从而使生物碱的萃取率迅速降低。因此选择最佳KCl 浓度为0.2 mol/L。

2.1.4萃取剂相比、萃取时间及反萃取时间的影响取“1.2.1”提取后的生物碱储备液，分别按体积比0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1加入DOLPA/AOT-异辛烷反胶束萃取剂，考察了萃取物体积与反胶束萃取剂用量相比的影响。结果显示，随着萃取剂用量的增大，生物碱的萃取率逐渐增大，这是因为一定量的反胶束萃取剂所含“水池”数目有限，对生物碱的萃取能力有限，随着萃取剂用量的增加，所萃取的生物碱更多，直至萃取剂相比达到4∶1(体积比)时，萃取剂可将生物碱萃取完全，继续增加萃取剂，萃取率变化不大。故选择最佳萃取相比为4∶1(体积比)。

考察了萃取时间对生物碱萃取率的影响。结果表明，当萃取时间为2～10 min 时，随着萃取时间的延长，生物碱的萃取率增加，萃取10 min时萃取率达最大，继续延长萃取时间，生物碱的萃取率基本不变。原因可能是在萃取开始阶段，表面活性剂层与水相中的生物碱充分接触，生物碱受静电引力作用与表面活性剂电性相反的极性头结合被包裹在反胶束内，达到动态平衡后，反胶束的形成与破坏速度相当，体系中反胶束数量不因萃取时间的延长而增加，因而萃取率不再增加。进一步考察了反萃取时间对生物碱萃取率的影响，结果显示，随着反萃取时间的延长，生物碱的萃取率不断增加，且在30 min时达到平衡，这是由于反萃取需破坏反胶束胶团，因此所需时间比萃取时间长。综合考虑，选择萃取时间为 10 min，反萃取时间为30 min。

综上所述，最佳反胶束萃取条件为：DOLPA/AOT为表面活性剂，DOLPA/AOT的总浓度为0.6 mol/L，水相pH值为4.0，KCl浓度为0.2 mol/L，萃取相比为4∶1，萃取时间为 10 min，反萃取时间为30 min。

2.2 倒提壶中4种生物碱的含量测定

2.2.1色谱条件与系统适应性试验对倒提壶粗提液和反胶束萃取后提取液进行UPLC分析，结果表明，粗提液中杂质较多，且毛果天芥菜碱和天芥菜定均无法完全分离(图4A)，经反胶束萃取后，提取液的杂质较少，4种生物碱均得到良好分离，且分离度(R)均大于1.5(图4B)。

考察了有机相(乙腈、甲醇)与不同水相(二乙胺、三乙胺、氨水)按不同配比作为流动相的分离效果，结果表明，以乙腈-0.2%三乙胺为流动相时的分离效果较好。采用二极管阵列检测器分别对4种生物碱的对照品溶液在200～400 nm 进行全波长扫描，结果显示4种生物碱在254 nm 处均有良好的紫外吸收，且响应信号较稳定。因此，本文的最佳色谱条件如“1.2.5”所示，在该条件下，天芥菜品、天芥菜碱、毛果天芥菜碱和天芥菜定的保留时间分别为4.18、7.47、9.40、12.42 min，与 HPLC 法[7]相比大大缩短了分析时间，且色谱峰峰形好、对称，柱效更高。

2.2.2线性关系与检出限取一定量的4种生物碱混合标准品，配制成一系列浓度的混合标准溶液，分别进样10 μL按本方法进行分析，以峰面积(A)和质量浓度(ρ，mg/L)绘制标准曲线，按3倍信噪比(S/N=3)计算检出限，4种生物碱的标准工作曲线、线性范围及检出限见表1。由表1可知，4种生物碱的相关系数均大于0.999，检出限为0.020～0.050 mg/L，满足倒提壶提取液中生物碱的含量测定要求。

表1 4种生物碱的标准曲线、相关系数(r)、线性范围及检出限Table 1 Calibration curves,correlation coefficients(r),linear ranges and detection limits of four alkaloids

2.2.3精密度、稳定性及重复性精密称取倒提壶药材细粉6份，按“1.2”方法分别进行萃取、处理和测定，取样品和对照品溶液于室温下放置0～12 h，并取同一样品进样测定5次。结果表明，天芥菜品、天芥菜碱、毛果天芥菜碱和天芥菜定精密度的相对标准偏差(RSD,n=3)分别为1.8%、1.9%、1.1%、1.5%，稳定性的RSD(n=3)分别为2.3%、1.7%、1.2%、1.3%，重复性的RSD(n=3)分别为1.7%、2.0%、2.3%、0.9%。表明仪器的精密度良好，分析方法具有良好的重复性和稳定性。

2.2.4加标回收实验精密称取已测定含量的倒提壶样品9 份，按照高、中、低3个浓度分别加入天芥菜品、天芥菜碱、毛果天芥菜碱和天芥菜定对照品溶液，按“1.2”方法制备供试品溶液并进行测定。天芥菜品、天芥菜碱、毛果天芥菜碱和天芥菜定的回收率分别为98.2%～103%、97.9%～102%、98.1%～101%、97.8%～104%，RSD(n=3)分别为 1.5%、1.1%、1.7%、1.9%。

2.3 实际样品的应用

精密称取3个批次的倒提壶药材各100 g，采用本方法萃取药材中的4种生物碱后进行测定，并与“1.2.4”所示的溶剂萃取法(SRE)进行对比，结果见表2。由表可知，经DOLPA/AOT-异辛烷萃取后4种生物碱的萃取效率约为氯仿溶剂萃取法的2倍。原因可能为反胶束萃取法主要通过静电作用力使目标物增溶到“水池”中，萃取过程与有机溶剂隔绝，萃取条件温和，不改变萃取物的生物活性，可以实现被萃取物质与溶剂的彻底分离，萃取率高，工艺简单、省时省力。

表2 不同批次的提取分析结果(n=3)Table 2 The results extracted from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm(n=3)

3 结 论

本文将DOLPA/AOT-异辛烷反胶束萃取技术应用于倒提壶中4种生物碱的萃取，通过单因素试验对生物碱的萃取条件进行了优化，建立了生物碱含量的UPLC测定法。本方法萃取率高，且反胶束可重复利用，萃取成本低，绿色环保；UPLC法的分析时间短，所用溶剂少，灵敏度及重现性好，精密度高，可满足倒提壶药材中4种生物碱的检测要求。