蒙药材制牛鞭的质量标准研究

邢界红 刘庆玲 岳景茁 邓伟明

(内蒙古自治区蒙药股份有限公司，内蒙古 通辽 028000)

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(赛默飞，型号：U3000)、效液相色谱仪二极管阵列检测器、电子天平(十万分之一 型号：CP225D)；

1.2 试剂与试药 异硫氰酸苯酯(PITC)购自北京百灵威科技有限公司 标示纯度≥98%；甘氨酸(批号 140689-201605)、丙氨酸(批号 040680-201303)、脯氨酸(批号 140677-201206)由中国食品药品生物制品鉴定所提供；乙腈、乙酸钠、盐酸、三乙胺均为分析纯，市售。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别 取本品粉末5g，置索氏提取器中，加乙醚70mL，加热回流30min，溶液蒸干，残渣加乙醚2mL使溶解，作为供试品溶液。另取胆固醇对照品，加乙醚制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502 )试验[1]，吸取上述2种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-丙酮(4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以乙醇-浓硫酸-醋酐(10:1:1)的溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见图(5为对照品，9为阴性对照，其它为7批样品)。

2.2 浸出物 取制牛鞭(批号：201608001)，分别照水溶性浸出物测定法和醇溶性浸出物测定法[2](《中国药典》2015年版四部通则2202)项下的冷浸法和热浸法测定，浸出物结果显示水热浸法43.18%，水冷浸法35.98%；95%乙醇热浸法15.60%，95%乙醇冷浸法12.30%；75%乙醇热浸法21.28%，75%乙醇冷浸法17.99%，因水溶性热浸出物含量较高且溶剂为水，故本品浸出物选择采用水溶性浸出物测定方法的热浸法测定，浸出物结果显示，7批样品水溶性热浸出物的平均值为33.03% ，最高38.99% ，最低26.01%，因此将浸出物含量暂定为不得少于25.0%。

2.3 含量测定

2.3.1 方法 照高效液相色谱法(通则0512)测定：含量=CR× Ax /ARCR为对照品浓度、Ax为供试品峰面积、 AR为对照品浓度。

2.3.2 色谱条件[3]赛默飞高效液相色谱仪 型号(μLtimate3000)紫外∕二级管阵列检测器 Chromeleon7工作站 色谱柱：①ΜLtimate plus SN:P18151625 C18(4.6mm×250mm)；②Thermo SN：10306598 C18(4.6mm×250mm)③Inertsustain SN:6LR98043 C18(4.6mm×250mm)；柱温43℃；以乙腈-0.lmol·L-1乙酸钠溶液(用乙酸调节p H 值至6.5)(7 : 93)为流动相A ，以乙腈-水(4 : 1)为流动相B ，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm，进样量5μL。

表1 流动相

表2显示：研究组患者的残余尿量(98.6±38.5)mL较对照组(136.3±52.2)mL明显减少，切(P< 0.05)，差异有统计学意义。

2.3.3 对照品溶液的制备 取甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、脯氨酸对照品适量，精密称定，加0.lmol·L-1盐酸溶液制成每1mL含甘氨酸0.1mg·mL-1、丙氨酸对照品0.1mg·mL-1、脯氨酸0.1mg·mL-1的混合溶液，即得。

2.3.4 供试品溶液的制备 取本品(过三号筛)约0.25g，精密称定，置25mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液20mL，超声处理(功率300W，频率40kHz)30min，放冷，加0.lmol·L-1盐酸溶液至刻度，摇匀。精密量取5mL，置20 mL安瓿中，加盐酸5mL,150°C水解1h，放冷，转移至蒸发皿中，用水10mL分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol·L-1盐酸溶液使溶解，转移至25mL量瓶中,加0.1mol·L-1盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。

精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各5mL，分别置25mL量瓶中，各加0.1mol·L-1异硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液2.5mL，lmol·L-1三乙胺的乙腈溶液2.5mL，摇匀，室温放置1 h后，加50%乙腈至刻度，摇匀。精密吸取10mL，加正己烷10mL，振摇，放置10min，取下层溶液，滤过，取续滤液，即得。

空白溶液 取0.lmol·L-1盐酸溶液5mL，精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各5mL， “置25mL量瓶中，各加0.lmol·L-1异硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液2.5mL”起，依法测定含量，即得。

2.3.5 系统适用性试验 峰纯度试验：采用高效液相色谱仪二极管阵列检测器检测，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测得结果对照品与供试品色谱峰匹配值均大于95%。

分别吸取上述对照品溶液、供试品溶液及空白溶液各5μL，按色谱条件进行测定,结果样品色谱中甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸3个氨基酸色谱峰分离度良好,空白无干扰。

2.3.6 提取效率的考察 超声时间考察 以0.1mol·L-1盐酸溶液作为提取溶剂进行超声外理(功率300W，频率40kHz)，为保证被测成分提取完全，实验中考察了超声提取20min、30min、40min不同时间对提取效率的影呴，结果表明超声处理20min、30min和40min含量基本一致，故超声时间定为30min。

酸水解时间考察 在提取过程中，对柱前酸水解时间进行考察，结果可见，超声水解30min、60min和90min含量基本一致，故水解时间定为60min。

2.3.7 线性关系考察 分别吸取上述对照品溶液2μL、5μL、8μL、10μL、12μL、15μL注入液相色谱仪，测得峰面积。分别以氨基酸对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果见下表2～4。

表2 线性关系考察—甘氨酸

表3 线性关系考察—丙氨酸

表4 线性关系考察—脯氨酸

分别以氨基酸对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。从而得出二者具有极好的线性相关性，相关系数r均大于0.999。

2.3.8 稳定性 取供试品按上述色谱条件分别于0.3.6.9.12.h测定峰面积计算甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸3个氨基酸色谱峰峰面积的RSD分别为0.08%、0.32%、1.77% ，供试品溶液在12h内稳定。

2.3.9 精密度 取供试品溶液按照上述色谱条件连续进样6针，测定峰面积甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸3个氨基酸的RSD分别为0.05%、0.09%、0.68%。结果表明，仪器的精密度良好。

2.3.10 重复性 取同一批次的制牛鞭6份，按含量测定项下方法操作，测定每份样品的含量，甘氨酸平均含量40.73 mg·g-1， RSD%=0.56%；丙氨酸平均含量22.09 mg·g-1， RSD%=1.69%；脯氨酸平均含量23.54 mg·g-1， RSD%=0.37。

2.3.11 加样回收试验 取甘氨酸对照品加0.1mol·L-1盐酸制成每1mL含2.396mg的溶液，取丙氨酸对照品加0.1mol·L-1盐酸制成每1mL含1.397mg的溶液，取甘氨酸对照品加0.1mol·L-1盐酸制成每1mL含1.702mg的溶液，另取已知含量制牛鞭样品(批号：201608005，甘氨酸含量40.73mg·g-1、丙氨酸含量22.09 mg·g-1、脯氨酸含量23.54 mg·g-1)约0.125g，共6份，精密称定，分别加入上述甘氨酸对照品溶液2mL、丙氨酸对照品溶液3mL、脯氨酸对照品溶液2mL(约相当于供试品含量的100%)，照前述方法测定，并计算回收率，结果见表5～7。

表5 加样回收试验结果-甘氨酸

表6 加样回收试验结果-丙氨酸

表7 加样回收试验结果-脯氨酸

2.3.12 样品测定 取制牛鞭样品0.25g，精密称定，按上述方法操作，并按干燥品计算含量。制牛鞭7批样品的含量测定结果见表8～10。

样品测定结果表明，7批样品甘氨酸平均含量为38.98mg·g-1，丙氨酸平均含量26.75mg·g-1，脯氨酸平均含量22.65mg·g-1，按平均值的80%(-20%)制定含量限度甘氨酸31.18mg·g-1，丙氨酸21.4 mg·g-1，脯氨酸18.12 mg·g-1，取整数，限度暂定为甘氨酸30.0 mg·g-1，丙氨酸20.0 mg·g-1，脯氨酸18.0 mg·g-1。

表8 样品测定试验—甘氨酸

表9 样品测定试验—丙氨酸

表10 样品测定试验—脯氨酸