银杏内酯A对老年大鼠心肌细胞收缩功能的影响

郝艳玲，薛 敏，孙 红，曾晓荣

(徐州医科大学1.基础医学国家级实验教学示范中心机能实验分中心、2.生理教研室，江苏 徐州 221004；3.西南医科大学医学电生理学教育部重点实验室心血管医学研究所，四川 泸州 646000)

近年来，银杏叶提取物对心脑血管循环系统有改善作用已有较多报道。虽然银杏叶提取物中的活性成分很多，但在拮抗血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)方面，它的活性成分中的银杏内酯A、B、C是PAF天然的特异性拮抗剂[1]。一般缺血预处理只能起到预防作用，而缺血后处理却能起到治疗作用，且药物性缺血后处理，相对于手术的风险小，因而有着更好的临床应用价值。研究发现，银杏内酯A预处理，可改善成年大鼠离体心脏缺血状态[2]，缺血性心肌病是老年人的好发病，目前研究表明，银杏内酯A后处理，对老年大鼠心功能的影响，尤其是对缺血的单个心肌细胞收缩功能的研究甚少。因而，本实验通过使用银杏内酯A后处理的方式，研究其对缺血/再灌注损伤的老年大鼠单个心肌细胞收缩功能的影响，并探究其发挥作用是否与PI3K/Akt信号通路有关。

1 材料与方法

1.1实验动物正常健康清洁级SD老年大鼠，♂，20～24月龄，体质量(400±50)g，由徐州医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2012-0032。

1.2试剂与仪器银杏内酯A(德国Fluka公司)，溶于二甲基亚砜(DMSO)中[3]；LY294002(Sigma公司，批号：092M4616V)；Ⅱ型胶原酶(Gibco公司)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)；蛋白提取试剂盒、NBT/NCIP显色试剂盒(碧云天生物技术公司)；p-Akt、Bcl-2、Bax一抗(Cell Signaling公司)；其他试剂均为国产分析纯。Langendorff灌注装置(澳大利亚AD Instrument)；酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3分离单个心肌细胞参照实验室常用的方法[3]，SD老年大鼠腹腔注射肝素约10 min后，颈椎脱臼处死，取出心脏置冰浴台氏液中，剪去除主动脉以外心脏周围其他的组织，并把主动脉插入Langendorff灌注架上，用线结扎固定。用无钙台氏液灌5 min，接着改用含0.5 g·L-1Ⅱ型胶原酶和钙的台氏液循环灌流25 min左右，待心脏变软，迅速剪下左心室部分，置氧饱和的KB液中撕碎，过滤出单个心肌细胞，并让其自然沉降，弃上清，用KB液洗涤沉淀3次后，接种于无血清高糖DMEM中，在12孔板中的浓度为2×104个细胞/孔，于CO2培养箱中正常培养2 h。

1.4细胞模拟缺血/再灌注模型的制备[3]随机将分离的老年大鼠心肌细胞分为3组，正常对照组(Control组)：心肌细胞在CO2培养箱中正常培养5 h；缺血/再灌注损伤组(I/R组)：即模拟缺血/再灌注损伤，先将老年心肌细胞放置于无糖培养基中，并于三气培养箱(37℃、94% N2、5% CO2和1% O2)培养3 h，之后放入CO2培养箱正常培养基培养2 h视为模拟复灌；银杏内酯A组(GA组)：将模拟缺血3 h后的老年单个心肌细胞放入加有银杏内酯A的正常培养基中，正常培养2 h，GA组又分为5个浓度组(GA 0.1组、GA1组、GA10组、GA30组、GA100组)，其在培养基中的终浓度分别为0.1、1、10、30、100 μmol·L-1。采用盲法在显微镜下计数一定数量的心肌细胞，存活率/%=长杆状细胞数/总细胞数×100%。吸取少量心肌细胞测定其收缩功能，剩下用于测定蛋白含量。

1.5心肌细胞收缩功能测定[3]吸取少量心肌细胞，滴加在含有2 mmol·L-1钙的KH液恒流(37℃)的细胞浴槽内，并给予0.5 Hz的电刺激。选取细胞膜完好、横纹比较清晰、杆状的心肌细胞(放大400倍)，记录并分析其收缩情况。用Optical Measure软件分析，计算心肌细胞收缩幅度(%)、收缩时间(time-to-peak，TTP)、舒张50%时间(R50)、舒张100%时间(R100)。并确定银杏内酯A的最佳浓度。

1.6LDH和SOD含量的测定收集各组培养基上清，按试剂盒说明书测定LDH和SOD的释放量，严格按照操作规程，使用酶标仪测定。

1.7Westernblot检测细胞Bcl-2、Bax和p-Akt蛋白的表达由收缩功能确定的银杏内酯A最佳浓度为30 μmol·L-1。LY组：在心肌细胞模拟缺血3 h后，即复灌开始时，细胞培养基中加入终浓度为20 nmol·L-1的LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂)。GA+LY组：在复灌时，培养基中加入30 μmol·L-1的银杏内酯A及与LY组相同浓度的LY294002。继续正常培养2 h后，收集细胞，加入裂解液，离心取上清，用BCA法测定蛋白浓度，取蛋白样品进行15% SDS-PAGE(10%分离胶，5%浓缩胶)电泳分离，并移至PVDF膜上，封闭2 h后，用p-Akt、Bcl-2、Bax一抗(1 ∶1 000)4℃孵育过夜，洗膜，二抗结合2 h，再洗膜，加入显色剂(NBT/NCIP显色试剂盒)，流水洗涤终止反应。内参对照用β-actin(1 ∶5 000)。定量分析，对照组光密度为1，其余组与其比较。结果重复3次。

2 结果

2.1心肌细胞存活率如Fig 1所示，与Control组比较，其余各组的心肌细胞存活率明显下降(P<0.01)。但与I/R组相比，银杏内酯A后处理后，能够增加心肌细胞的存活率，在浓度为10、30 μmol·L-1时差异有显著性(P<0.01)。

Fig 1 Effect of ginkgolide A post-treatment on viabilityof aged rat cardiomyocytes after I/R

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsI/R

2.2培养基中LDH的含量和SOD的活性Tab 1结果显示，与Control组比较，其余各组细胞培养基中的LDH含量明显增加；与I/R组比较，银杏内酯A后处理以后，GA10、GA30组培养基中的LDH含量明显降低(P<0.05)。与Control组比较，其余各组的SOD含量明显下降；与I/R组比较，GA10、GA30组培养基中SOD的含量均明显增加(P<0.01)。

Tab 1 Release of LDH and SOD in differentgroups′media after 2 h stimulated

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsI/R

2.3心肌细胞收缩功能

2.3.1心肌细胞收缩幅度变化 如Fig 2所示，与Control组比较，其余各组的心肌细胞收缩幅度明显下降；与I/R组比较，银杏内酯A后处理以后，GA10、GA30组心肌细胞的收缩幅度明显增强(P<0.05)，而银杏内酯A在低浓度和高浓度时，对心肌细胞的收缩幅度没有影响。

Fig 2 Effect of ginkgolide A post-treatment on myocellularshortening amplitude in aged rats after I/R

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsI/R

2.3.2心肌细胞TTP、R50、R100变化 Tab 2结果显示，与Control组比较，其余各组的TTP都明显延长；与I/R组比较，GA10、GA30组TTP均明显缩短(P<0.05)。与对照组的R50比较，I/R组的时间明显延长，但与I/R组相比较，GA10组能明显缩短R50(P<0.05)。而在舒张100%的时间中，各组间差异无显著性。

Tab 2 Ginkgolide A post-treatment on changes of TTP,R50,R100 in cardiomyocytes suffered I/R n=10,ms)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsI/R

2.4银杏内酯A后处理对I/R损伤的细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响如Fig 3所示，与Control组相比，I/R组心肌细胞中Bcl-2蛋白含量明显下降，而Bax蛋白明显升高。不同浓度的银杏内酯A后处理后，Bcl-2蛋白含量却有不同程度的升高，Bax蛋白表达也有相应的下降，Bax/Bcl-2也明显下降。与I/R组相比，银杏内酯A的浓度在10、30 μmol·L-1时，差异有显著性(P<0.05)。

Fig 3 Ginkgoldie A post-treatment on changes of Bcl-2 and Baxproteins in stimulated ischemia aged rat

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsI/R

2.5银杏内酯A后处理对I/R损伤的老年大鼠心肌细胞中Akt磷酸化水平的影响由Fig 4可看出，每个组Akt总蛋白表达(T-Akt)差异并无显著性。但模拟I/R后，各组细胞中p-Akt蛋白表达升高，Akt磷酸化水平(p-Akt/Akt)增强。与Control组和I/R组相比，银杏内酯A明显提高了Akt磷酸化水平。联合用LY294002后，银杏内酯A提高Akt磷酸化水平的作用被部分抑制了(P<0.05)。提示银杏内酯A后处理的这种保护作用可能与其激活PI3K/Akt信号通路有关。

Fig 4 Effect of ginkgolide A post-treatment on expression ofp-Akt and Akt proteins in I/R aged rat

3 讨论

有研究发现，银杏内酯A无论在体内，还是体外都能够通过不同的通路来减弱炎症反应[4-5]，有较好的抗炎作用，并能够抑制各种早期炎症介质。血小板活化因子受体(platelet activating factor receptor，PAFR)是G蛋白偶联受体，它会出现在关键的靶细胞的炎症、免疫和止血过程中。当PAFR与其配体PAF或像PAF一类的脂质结合以后，就会引发各种细胞内的信号级联反应，并诱导一些功能变化，然后启动或放大炎症反应，形成血栓或最终凋亡。在缺血或缺氧组织中，PAF的积累是一个主要的损伤因素，PAF参与了心肌再灌注损伤过程。

研究发现，银杏内酯A后处理以后能够增强老年大鼠心肌细胞的存活率，浓度在10、30 μmol·L-1时能发挥更好的保护作用，证明了银杏内酯A起到了降低细胞损伤的作用。有研究发现[6]，5 μg·L-1的银杏内酯就能够明显降低心肌细胞的死亡率，在缺氧的心肌细胞中PAFR的mRNA表达增加，而银杏内酯却能降低其表达。在缺血阶段，银杏内酯能够调节PAFR以及PAF的乙酰水解酶，抑制和减弱心肌梗死，从而对缺血心脏起到保护作用。银杏内酯A降低老年心肌细胞凋亡是否通过调节PAFR mRNA的表达而起保护作用的，有待进一步研究。

另外，银杏内酯A还降低了培养基中LDH的含量，抑制了SOD活性的下降，说明其可对抗因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，减弱由自由基对细胞造成的伤害。这是由于银杏内酯A具有明显的抗氧化和自由基清除的作用[7]。

本研究结果发现，由于缺血造成的负性肌力作用可以被银杏内酯A后处理抑制，银杏内酯A浓度在10、30 μmol·L-1时能够有效抑制由缺血造成的单个心肌细胞收缩幅度的降低，并呈浓度依赖的方式。心肌细胞的收缩功能受收缩和舒张两方面的影响。研究发现，在缺血/再灌注损伤以后，TTP明显延长，说明缺血/再灌注损伤减弱了心肌细胞的收缩能力。而银杏内酯A后处理以后，明显地缩短了缺血造成的TTP的延长，增强了细胞的收缩力，缩短了R50，使得心肌细胞尽快恢复。但各组间R100没有差异，表明银杏内酯A并不能改变舒张时间，有助于心肌细胞更好地休息。这与之前在离体器官水平上，银杏内酯A预处理改善成年大鼠缺血/再灌注损伤的离体心脏收缩功能[2]的结果相一致。银杏内酯B对缺血后心肌细胞的收缩有改善作用，并减轻再灌注损伤[3]，可能与它调控一些钙调蛋白有关[8]。银杏内酯A后处理减轻老年大鼠的再灌注心肌损伤是否也通过这些机制，有待进一步研究。

研究发现，银杏内酯A后处理能够增加老年大鼠心肌细胞中p-Akt的表达，而LY294002能消弱这种作用，降低Bax/Bcl-2，减少了细胞死亡率。PI3K/Akt信号通路中Akt磷酸化降低后，一些促炎症因子表达会增强，并最终诱导心肌细胞凋亡[9]。Akt一旦被激活，可以使Bcl-2蛋白表达增强，并能够进一步抑制促凋亡蛋白如Bax、Bad、caspase等的形成。Bcl-2家族是PI3K/Akt信号通路的重要靶点，细胞的凋亡取决于Bax/Bcl-2，比值越高死亡率越高[10]。 因而，银杏内酯A对老年大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用，可能是通过影响PI3K/Akt信号通路，降低细胞凋亡来完成的，与银杏内酯B的作用机制相同[11]，是否可以考虑联合应用两种成分来治疗老年心肌缺血病，或许效果会更佳。

研究结果表明，银杏内酯A后处理对老年大鼠缺血/再灌注损伤造成的单个心肌细胞收缩功能障碍，具有改善作用，能够减少心肌细胞的凋亡，可能是通过PI3K/Akt信号通路完成的。因而，银杏内酯A后处理对老年人的心肌缺血病具有潜在的临床治疗作用。

(致谢：感谢徐州医科大学生理功能与损伤实验室为本实验提供的技术支持，感谢付璐、潘秀华老师和侯红件给予实验上的帮助。)