藏药雪灵芝粗多糖对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响※

张海燕，张 华，连紫宛，高笑笑，王 刚*

(1.青海大学医学院;2.青海省人民医院，青海西宁810001)

本研究组前期的研究结果显示，雪灵芝(Areneria Kensuensis)水溶性提取物具有抑制肿瘤生长、激活机体免疫的作用［1－2］。以此为基础，通过建立S180荷瘤小鼠模型进行体内研究，探讨雪灵芝粗多糖(Arenaria kansuensis crude polysaccharide，AKCP)对荷瘤鼠的肿瘤生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞

无特定病原体(SPF)级Balb/c小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，购自空军军区大学实验动物中心，动物合格证编号:0014827，动物许可证号:SCXK(军)2012－0007;S180细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂与仪器

雪灵芝(青海九康医药保健品有限公司)，注射用环磷酰胺(CTX，江苏盛迪医药有限公司)，Trizol Reagent(美国 Life technologies公司)，GoScriptTMReverse Transcription System(美国 Promega公司)，SuperReal荧光定量预混试剂(北京天根生化科技有限公司)，组织/细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，SuperECL Plus超敏发光液(普利莱基因技术有限公司)，兔抗小鼠CyclinD1、PCNA单克隆抗体(美国abcam公司)，兔抗小鼠Bax多克隆抗体、兔抗小鼠Bcl－2多克隆抗体、辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，兔抗小鼠β－actin多克隆抗体(上海生工生物工程股份有限公司)。

细胞培养箱(美国Forma公司)，LightCycler96全自动荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)，SDSPAGE电泳仪(Bio－Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 S180 小鼠移植瘤模型的建立

取生长状态良好的S180细胞，调整细胞浓度至5×106cells/mL，无菌条件下(按 0.2mL/只)给予Balb/c小鼠腹腔注射。7 d后抽取腹水，用0.9%氯化钠溶液洗涤细胞3次，并调整细胞浓度至2×107cells/mL，按每只 0.2 mL 接种于健康的Balb/c小鼠右前肢腋部皮下，建立小鼠S180移植瘤模型。

1.2.2 分组及处理

建模后次日，将40只S180荷瘤鼠随机分为5组:对照组，CTX 组，AKCP 高(AKCP－H)、中(AKCP－M)、低(AKCP－L)剂量组，每组 8 只。对照组每日给予蒸馏水0.5 mL灌胃;CTX组每日给予20 mg·kg－1的 CTX 腹腔注射;AKCP－H、－M、－L 组每日分别按 200、100、50 mg·kg－1浓度给予 AKCP溶液0.5 mL灌胃(本研究组按文献［3］提取 AKCP，得到冻干粉剂，用苯酚硫酸法测得总糖含量为52%，实验用AKCP以蒸馏水溶解)。

上述各组小鼠连续给药10 d后处死，无菌条件下剥取肿瘤实体，去除血污，称取瘤重，计算抑瘤率［(对照组平均瘤质量－给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%］。

1.2.3 S180实体瘤组织病理学的观察

切取部分瘤组织经10%福尔马林固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，进行HE染色，光学显微镜下观察瘤组织形态。

1.2.4 瘤组织 PCNA、CyclinD1、Ki67、Bcl－2 以及Bax mRNA的表达检测

用荧光定量法检测。取100 mg左右瘤组织，用Trizol法提取总 RNA，按 GoScriptTM Reverse Transcription System试剂盒说明书反转录成cDNA，按SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒说明书进行PCR扩增，反应条件:95℃预变性900 s，95℃变性10 s，60℃退火30 s，60℃延伸30 s，共40个循环。以β－actin作为内参基因，以模型组为对照组，参照文献［4］计算各因子mRNA相对表达量。

应用Primer 5.0设计引物，交由上海生工生物工程股份有限公司合成，上下游引物序列见表1。

1.2.5 瘤组织 PCNA、CyclinD1、Bcl－2 以及 Bax 蛋白的表达检测

用Western blot法检测。冷冻的瘤组织加入预冷的组织裂解液，研磨裂解，离心收集上清，用BCA法测定蛋白浓度。以30μg蛋白样品上样、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用湿转法转至PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭，加入 β－actin(1:2000)、CyclinD1(1:10000)、PCNA(1:10000)、Bcl－ 2(1:1000)和Bax(1:1000)等一抗，4℃过夜孵育，用PBST洗膜后，加入HRP标记的二抗，室温孵育2 h，加入ECL化学发光液，置于凝胶成像仪拍照，以Image J软件测定目的蛋白和内参蛋白条带的灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行分析，数据以均数±标准差(珋x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，检验水准α=0.05。

表1 荧光定量PCR引物序列Table 1 Sequences of Primers for quantitative real time PCR

2 结果

2.1 AKCP对S180荷瘤鼠肿瘤生长的抑制作用

AKCP－L组瘤体质量低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)(图 1，表 2)。

结果显示，CTX 组及 AKCP－H、AKCP－M、

图1 各组S180实体瘤形态图Figure 1 Image of morphology of sarcoma 180 solid tumor in each group

表2 AKCP对S180荷瘤小鼠瘤重的影响(n=8，±s)Table 2 Effect of AKCP on tumor weight of sarcoma 180 tumor－bearing mice(n=8，±s)

表2 AKCP对S180荷瘤小鼠瘤重的影响(n=8，±s)Table 2 Effect of AKCP on tumor weight of sarcoma 180 tumor－bearing mice(n=8，±s)

*:与对照组比较，P＜0.05.*:Compare with control group，P＜0.05.

组别Group剂量Does(mg/kg)瘤质量Tumor weight(g)抑瘤率Antitumor rate(%)对照组 Control － 0.915±0.251 －环磷酰胺 CTX 20 0.384±0.098* 58.033 AKCP 高剂量 AKCP－H 200 0.681±0.189* 25.574 AKCP 中剂量 AKCP－M 100 0.624±0.199* 31.803 AKCP 低剂量 AKCP－L 50 0.702±0.256* 23.279 F 6.766 P ＜0.001

2.2 AKCP对S180实体瘤组织病理学表现的影响

经HE染色，在光镜下观察，对照组瘤细胞形态及大小各异，核大深染，细胞数量多且排列密集;CTX组及AKCP各剂量组肿瘤组织出现不同程度坏死区，瘤细胞数量减少，排列稀疏，间质增多及白细胞浸润(图2)。

图2 AKCP对S180实体瘤组织病理形态的影响图(HE，×100)Figure 2 Effect of AKCP on pathological morphology of sarcoma 180 solid tumor tissue(HE，×100)

2.3 AKCP 对瘤组织 CyclinD1、PCNA、Ki67、Bcl－2以及Bax mRNA表达的影响

用2－△△Ct法计算瘤组织中各因子mRNA相对表达量。CTX组、AKCP－H、AKCP－M、AKCP－L组的CyclinD1、PCNA、Ki67、Bcl－ 2、Bax、Bcl－ 2/Bax mRNA表达量与对照组比较均无明显差异(P＞0.05)(表3)。

表 3 AKCP 对瘤组织中 CyclinD1、PCNA、Ki67、Bcl－2 和 Bax mRNA 相对表达及 Bcl－2/Bax 比值的影响结果(n=8，±s)Table 3 Effect of AKCP on the expression of CyclinD1，PCNA，Ki67，Bcl－2 and the relative expression of Bax mRNA and Bcl－2/Bax ratio in tumor tissue(n=8，±s)

表 3 AKCP 对瘤组织中 CyclinD1、PCNA、Ki67、Bcl－2 和 Bax mRNA 相对表达及 Bcl－2/Bax 比值的影响结果(n=8，±s)Table 3 Effect of AKCP on the expression of CyclinD1，PCNA，Ki67，Bcl－2 and the relative expression of Bax mRNA and Bcl－2/Bax ratio in tumor tissue(n=8，±s)

F 0.079 0.271 1.473 0.865 0.352 1.243 P 0.988 0.895 0.231 0.495 0.841 0.311

2.4 AKCP 对瘤组织中 CyclinD1、PCNA、Bcl－2 以及Bax蛋白表达的影响

用 Western blot法检测 CyclinD1、PCNA、Bcl－2以及Bax在各组中的表达(图3)，以上述因子的蛋白条带灰度与内参蛋白(β－actin)条带灰度的比值，作为各因子的相对蛋白表达量。结果显示，CTX组及AKCP－H、AKCP－M、AKCP－L组中上述各因子蛋白表达水平以及Bcl－2/Bax蛋白表达水平比值与对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)(表4)。

图3 各组瘤组织中β－actin、CyclinD1、PCNA、Bcl－2和Bax蛋白表达图Figure 3 Image of the protein expression ofβ－actin，CyclinD1，PCNA，Bcl－2 and Bax in tumor tissue in each group

表4 AKCP对瘤组织中 CyclinD1、PCNA、Bcl－2和 Bax蛋白表达及 Bcl－2/Bax比值的影响结果 (n=8，±s)Table 4 Effect of AKCP on the protein expression of CyclinD1，PCNA，Bcl－2，Bax and the Bcl－2/Bax ratio in tumor tissue(n=8，±s)

表4 AKCP对瘤组织中 CyclinD1、PCNA、Bcl－2和 Bax蛋白表达及 Bcl－2/Bax比值的影响结果 (n=8，±s)Table 4 Effect of AKCP on the protein expression of CyclinD1，PCNA，Bcl－2，Bax and the Bcl－2/Bax ratio in tumor tissue(n=8，±s)

组别 Group CyclinD1/β－actin PCNA/β－actin Bcl－2/β－actin Bax/β－actin Bcl－2/Bax对照组 Control 0.802±0.467 0.903±0.245 1.365±0.806 1.033±0.513 1.005±0.780环磷酰胺 CTX 0.453±0.415 0.911±0.489 1.259±0.726 1.473±0.860 1.450±2.336 AKCP 高剂量 AKCP－H 1.250±1.250 1.022±0.444 1.929±0.836 1.350±0.612 0.588±0.294 AKCP 中剂量 AKCP－M 1.286±1.550 1.550±2.145 1.801±1.548 1.634±0.994 0.902±0.584 AKCP 低剂量 AKCP－L 0.864±0.286 0.877±0.336 1.090±0.697 1.039±0.460 1.439±1.469 F 1.077 0.617 1.090 1.099 0.631 P 0.383 0.654 0.377 0.373 0.643

3 讨论

多糖(polysaccharides)是由十个以上的单糖通过糖苷键结合形成的高分子聚合物，广泛存在于自然界动植物中。近年来，多糖具有的低毒性的抗肿瘤作用日益被研究者重视。本研究显示，AKCP对S180荷瘤鼠肿瘤生长具有较明显的抑制作用，高、中、低剂量组抑瘤率分别为 25.574%、31.803%和23.279%。这与本课题组之前进行的雪灵芝水溶性提取物对H－22荷瘤鼠肿瘤生长具有抑制作用［2］的研究结果一致。

目前研究表明［5－6］，多糖可通过两个途径发挥抗肿瘤作用:其一为直接作用，即多糖通过调控细胞增殖与凋亡相关因子的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，发挥直接的抗肿瘤作用;其二为间接作用，即多糖通过激活机体抗肿瘤免疫细胞和因子，杀伤肿瘤组织，间接地发挥抗肿瘤作用。为了解AKCP是否是以直接抑制途径发挥对S180荷瘤鼠的抗肿瘤效应，本研究对瘤组织中与细胞增殖及凋亡相关因子的mRNA和蛋白表达水平进行了测定。在细胞增殖相关因子方面，CyclinD1作为细胞周期正性调节蛋白，通过调节CDK活性，加速细胞从 G1期进入 S期，在肿瘤组织中高表达［7］;PCNA作为增殖细胞核抗原，调节DNA多聚酶活性，对DNA复制起着重要作用，在增殖细胞中高表达［8］;Ki67是增殖性细胞标记物，在除G0期外的所有细胞周期中表达，也是反映细胞增殖水平的指标［9］。本研究观察了上述3个因子表达水平，结果显示，在AKCP高、中、低剂量组中，CyclinD1、PCNA和Ki67的mRNA表达水平，以及CyclinD1与PCNA蛋白表达水平较对照组接近，差异不具有统计学意义，提示AKCP不是通过直接作用途径抑制肿瘤细胞增殖。

在凋亡相关因子方面，Bcl－2基因家族中的抑凋亡基因Bcl－2、促凋亡基因Bax对细胞凋亡发挥重要的调控作用，二者表达量的比率，决定它们倾向于形成Bcl－2/Bax异源二聚体抑制细胞凋亡，还是倾向于形成Bax/Bax同源二聚体促进细胞凋亡［10］。荧光定量PCR与Western blot检测结果显示，AKCP各剂量组Bcl－2和Bax的mRNA及蛋白表达水平均略低于或高于对照组，且差异无统计学意义，而AKCP各剂量组Bcl－2/Bax mRNA及蛋白表达量的比值与对照组比较，有降低的趋势，但无统计学意义。此结果尚不能定论AKCP是否有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，有待通过体外实验进行进一步验证。

综合上述结果，本文从体内研究的角度，证实了AKCP具有明显的抑制S180荷瘤小鼠瘤体生长的效应，为今后探索雪灵芝这一宝贵的高原植物的药用价值提供了依据。然而，体内实验虽能综合地反映药物的整体效应，但用于细胞、分子水平的机制研究，受一些干扰因素的限制，如瘤体间质中存在不同程度增生的成纤维细胞、血管内皮细胞和浸润的免疫细胞，以及实验动物的个体间差异等。因此，对AKCP抗肿瘤机制的探究，一方面有待进一步开展体外实验，观察AKCP对体外培养肿瘤细胞增殖的影响，在直接性抑瘤作用途径方面对本研究结果进行补充、验证;另一方面，需要在本研究组前期研究所显示的AKCP具有较强的免疫激活作用基础上［11，12］，观察 AKCP 对 S180 荷瘤小鼠免疫细胞、免疫因子活化水平的影响。