藏药烈香杜鹃挥发油在体外杀伤多房棘球蚴药效研究※

李润乐，李占强，廖梦娇，汤 锋，杨全余#，格日力§

(1.青海大学高原医学研究中心，青海西宁810001;2.青海大学高原人畜共患病研究所，青海 西宁810001;3.青海－犹他高原医学联合重点实验室，青海西宁810001;4.青海大学附属医院肝胆胰外科，青海西宁810001)

泡型包虫病晚期病灶侵犯到门静脉及转移至脑部的多发性病人无法进行手术治疗，只能通过药物抑制病灶发展［1］。现如今治疗包虫病主要使用阿苯达唑，但该药需要长期高剂量服用，所以出现很多副作用(肝功能异常、血检指标异常等)［2，3］。因此寻找新的治疗包虫病的药物具有十分重要的意义。

杜鹃花科植物具有较强的杀虫作用，是否对多房棘球蚴有杀灭作用未见报道。烈香杜鹃(Rhododendron anthopogonoides Maxim)是藏药达里主要成分之一，常用于治疗慢性支气管炎和冠心病［4－6］。本研究采用水蒸气蒸馏法从烈香杜鹃叶中提取挥发油，在体外对多房棘球蚴进行杀伤实验，通过扫描电镜观察其表面结构，初步明确烈香杜鹃挥发油对多房棘球蚴的杀灭作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器设备

烈香杜鹃叶(青海省大通县，购自青海藏药材市场)，DMEM(Gibico)，青霉素－链霉素混合溶液(Solarbio)，FBS(BI)，阿苯达唑(TCI，纯度＞98%)，吡喹酮(Solarbio，纯度＞98%)。

LSM 800激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss Jena)，RE－3000B旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，DHG9070B鼓风干燥箱(上海高致精密仪器有限公司)，BB15 型培养箱(Thermo)，Axio Vert.A1 型光学显微镜(Carl Zeiss Jena)。

1.2 方法

1.2.1 药物提取

称取50 g烈香杜鹃叶置于500 mL烧瓶，加入去离子水没过药材，浸泡过夜，采用水蒸气连续加热回流法蒸馏6 h，收集淡黄色挥发油3.2 mL，所得挥发油用无水Na2SO4干燥，备用。

1.2.2 原头蚴的分离及体外培养

脱颈处死感染多房棘球蚴的沙鼠，无菌条件下分离沙鼠腹腔内囊块，在生理盐水中剪碎，用45目尼龙网过滤，过滤后溶液使用300目尼龙网过滤，收集网上沉淀，用生理盐水(含1%青霉素－链霉素)清洗沉淀。将沉淀置DMEM培养基(1%青霉素－链霉素，10%FBS)放入培养箱中培养(37℃，5%CO2)。

1.2.3 药物活性的检测

烈香杜鹃挥发油用DMEM培养基稀释至10 mg/mL，将2 mL稀释液加入到激光共聚焦培养皿中，在玻底加入1 000个原头蚴置活细胞工作站(37℃，5%CO2)培养，使用激光共聚焦显微镜动态观察。

取烈香杜鹃挥发油50 mg，使用DMEM培养基稀释挥发油至10、5、1 mg/mL。将1 000个原头蚴培养在6孔板中，每组三个复孔，在培养箱中培养(37℃，5%CO2)。将阿苯达唑和吡喹酮分别用DMEM培养基稀释至10 mg/mL，作为药物对照。

用原头蚴溶液和伊红溶液1:1混合染色后置普通光镜下观察判断。判断标准:死亡原头蚴被伊红染色成红色且无活动性，活原头蚴未着色且具活动性。吸取原头蚴溶液10μL，计数原头蚴着色数目，计数3次，死亡率(%)=(着色原头蚴数量/原头蚴总量)×100%。

1.2.4 原头蚴扫描电镜观察

用3%戊二醛固定原头蚴15 h、PBS清洗3次后用1%锇酸固定1 h、PBS清洗3次、双蒸水清洗2次后，依次用浓度为 50%、70%、80%、90%、100%、100%乙醇及叔丁醇脱水处理。最后将标本于临界点干燥、喷金、观察。

1.2.5 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。结果以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，多重两两比较使用Dunnett－t检验或LSD检验，检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 烈香杜鹃挥发油对多房棘球蚴的杀灭作用

将1 000个原头蚴加入到烈香杜鹃挥发油稀释液中 (10mg/mL)，在活细胞工作站中实时观察原头蚴的变化。结果如图1所示，在杜鹃挥发油的作用下，个别原头蚴死亡 (黑色箭头所示)，原头蚴活性下降，运动减缓;阿苯达唑组在实验过程中没有发现死亡原头蚴，但原头蚴活性较差，头节外翻者较少;空白对照组中原头蚴头节均外翻，处于活跃状态。

图1 激光共聚焦显微镜下杜鹃挥发油对多房棘球蚴的杀伤效果图Figure 1 Killing effect of Rhododendron anthopogonoides Maxim Oil on protoscoleces

2.2 烈香杜鹃挥发油对多房棘球蚴杀灭作用的药效学评价

将含有10 mg/mL杜鹃挥发油、10 mg/mL阿苯达唑及10 mg/mL吡喹酮的培养基与原头蚴共培养。0.75 h后用伊红染色，光镜下观察发现10 mg/mL杜鹃挥发油组内原头蚴全部被伊红染色，如图2A所示;10 mg/mL阿苯达唑原头蚴未被伊红染色，如图2B所示;10 mg/mL吡喹酮作用下，原头蚴头部变大，没有被伊红染色，如图2C所示。空白对照组原头蚴没有被伊红染色。经药物作用0.75 h后各组原头蚴的死亡率见表1。

图2 10 mg/mL杜鹃挥发油对原头蚴的杀伤作用图Figure 2 The effect of 10 mg/mL Rhododendron anthopogonoides Maxim Oil on protoscoleces

表1 10 mg/mL杜鹃挥发油与原头蚴共培养0.75 h后死亡率(±s)Table 1 Mortality of protoscoleces after culture with 10mg/mL of Rhododendron anthopogonoide Maxim Oil 0.75 h( ±s)

表1 10 mg/mL杜鹃挥发油与原头蚴共培养0.75 h后死亡率(±s)Table 1 Mortality of protoscoleces after culture with 10mg/mL of Rhododendron anthopogonoide Maxim Oil 0.75 h( ±s)

*:与对照组比较 P＜ 0.001;#:与阿苯达唑比较 P＜ 0.001;△:与吡喹酮比较 P＜ 0.001.

组别 n 死亡率(%)

将浓度为5、1 mg/mL杜鹃挥发油与原头蚴体外培养12 h后，伊红染色发现5 mg/mL杜鹃挥发油中原头蚴大部分被伊红染色，只有少数未染;1 mg/mL杜鹃挥发油中原头蚴部分被伊红染色，如图3所示。经不同浓度杜鹃挥发油作用12 h后各组原头蚴死亡率见表2。

图3 5 mg/mL和1 mg/mL杜鹃挥发油对原头蚴的杀伤作用图Figure 3 The effect of 5 mg/mL and 1 mg/mL of Rhododendron anthopogonoides Maxim Oil on protoscoleces

表2 5 mg/mL和1 mg/mL杜鹃挥发油与原头蚴共培养12 h后死亡率(±s)Table 2 Mortality of protoscoleces after culture with 5 mg/mL and 1 mg/mL of Rhododendron anthopogonoide Maxim Oil 12 hours(±s)

表2 5 mg/mL和1 mg/mL杜鹃挥发油与原头蚴共培养12 h后死亡率(±s)Table 2 Mortality of protoscoleces after culture with 5 mg/mL and 1 mg/mL of Rhododendron anthopogonoide Maxim Oil 12 hours(±s)

*:与对照组比较 P＜ 0.001.

组别 n 死亡率(%)对照组30.900±0.200 5 mg/mL 杜鹃挥发油组 3 80.000±2.000*1 mg/mL 杜鹃挥发油组 3 43.000±2.000*F 1376.692 P＜0.001

2.3 对杜鹃挥发油作用后原头蚴的超微结构观察

多房棘球蚴用10 mg/mL杜鹃挥发油作用后立刻用3%戊二醛固定，做扫描电镜检查。结果如图4所示，原头蚴在杜鹃挥发油作用后体表微绒毛消失，体表凹凸不平，头部损伤并且钩脱落，而正常对照组原头蚴体表微绒毛丰富，体表光滑完整。

图4 杜鹃挥发油作用后原头蚴的扫描电镜结果图Figure 4 Structural changes of the protoscoleces treated with Rhododendron anthopogonoides Maxim Oil

3 讨论

阿苯达唑是临床上用于治疗包虫病的首选药物，阿苯达唑作用于虫体延胡索酸还原酶系统，抑制三磷酸腺苷生成，从而使虫体无法生存和繁殖［7］。吡喹酮是常用的肠道寄生虫驱虫药，专门治疗绦虫及吸虫类，可使虫体发生强直性收缩而产生痉挛性麻痹［8］。本研究使用阿苯达唑及吡喹酮作为对照药物，阿苯达唑是代谢系统抑制剂因此药效时间较长，所以在本研究结果中未出现多房棘球蚴大量死亡(图1)。有报道称，吡喹酮在1 mg/mL以上就可使虫体肌肉瞬间收缩［9］，在虫体形态表现为头部变大、尾部变小，这与我们所观察到的结果相一致(图2)。多房棘球绦虫在肠道寄生时主要使用吸盘和钩定植在小肠绒毛间，所以吡喹酮作用可使其无法固定在小肠绒毛间，从而达到驱虫效果。

烈香杜鹃在藏药中通常以花、叶和嫩枝入药，有止咳化痰、清热消肿、补脾益气等功效［10］。虽然烈香杜鹃常用于气管炎、肺气肿和冠心病，但是有报道称杜鹃花科植物也具有杀虫作用，如闹羊花全株可供做农药，药理作用有去癣杀虫的功效，并且杀虫毒力仅次于除虫菊［11］。有研究表明，烈香杜鹃挥发油部分具有抑菌作用，对白色葡萄球菌、四联球菌、肺炎球菌、甲型链球菌及干燥球菌有抑制作用［12］。本研究发现使用烈香杜鹃挥发油在10 mg/mL浓度时，在0.75 h可基本杀灭多房棘球蚴，5 mg/mL和1 mg/mL在12 h时多房棘球蚴的死亡率分别是80%和43%，证明烈香杜鹃挥发油对多房棘球蚴具有较强的杀灭作用。

有研究对烈香杜鹃挥发油化学成分分析发现，其中主要成分有苄基丙酮、榄香烯、D－柠檬烯等［13］。其中榄香烯可抑制肿瘤细胞的DNA和RNA的合成、诱导肿瘤细胞的凋亡和分化［14］;D－柠檬烯具有消炎、抑菌、抗肿瘤功效［15］。本研究仅说明烈香杜鹃挥发油对多房棘球蚴具有杀伤作用，但具体是哪种化合物发挥作用以及明确的作用靶点、作用机制需进一步研究阐明。