关键酶基因的过表达与环境因素对大肠杆菌血红素合成的调控

2018-12-15 02:56陈丹园沈云杰杨燕唐蕾
食品与发酵工业 2018年11期
关键词:双酶共表达血红素

陈丹园,沈云杰,杨燕,唐蕾,*

1(江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡,214122) 2(江南大学 生物工程学院,江苏 无锡,214122)

血红素是包含原卟啉及环中配位的二价铁离子的小分子物质[1],广泛存在于动植物和微生物中,主要发挥三大作用:一是血红素中的铁和整体铁元素的转换平衡直接关系到细胞甚至整个生命体能否正常运转[2];二是血红素具有间接抗氧化的功能,血红素的降解物质胆绿素和胆红素是活性氧很好的捕获剂,可以维持细胞内氧化还原氛围的稳定[3];三是作为血红素蛋白的辅基,酶结合辅基后具备活性来维持生命体的正常运转[4],这些酶在气体运输储存[5-6]、呼吸链的氧化还原能量代谢及电子传递[7-8]、调控信号通路[9-10]等过程中发挥着至关重要的作用。

大肠杆菌作为基因工程的常用宿主菌,主要以C5途径合成各种卟啉物质(图1),既可用于生产血红素又可表达血红素结合蛋白,但是血红素的产量不足成为相关研究中的主要限制因素。国内外学者围绕如何提高血红素合成前体ALA开展了大量研究工作。例如,康振等[11]将来自于Salmonellaarizona的突变基因hemAM与大肠杆菌的hemL基因共表达于E.coliDH5α,发现ALA产量大幅度提高。LEE等[12]提出hemD能加速内源ALA的产生。YU等[13]经转录分析提出hemA和hemL共表达后造成糖酵解途径被抑制,ALA积累会刺激血红素合成和呼吸代谢。

图1 大肠杆菌血红素合成途径Fig.1 The heme pathway of E.coli

上述研究表明在大肠杆菌中血红素的合成受到多种酶的调控,且大肠杆菌本身卟啉合成途径中的关键基因表达对终产物血红素的贡献尚不清楚,为此本研究构建了源于E.coliBL21的gltX、hemA、hemB、hemD、hemH和hemAD与pET28a的重组质粒进行同源表达,并考查了环境对Eco/pEA合成血红素过程的中间产物ALA和终产物血红素产量影响,为大肠杆菌本身的C5途径酶的调控及其环境影响作出相应分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

1.1.2 酶和试剂

引物由华大基因合成;限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、NotⅠ和XhoⅠ和T4 DNA连接酶均购自Takara公司;CloneEZ PCR克隆试剂盒购自南京金斯瑞生物科技有限公司;5-氨基乙酰丙酸盐酸盐标准品、牛血红蛋白及草酸购自Sigma公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、硫酸卡那霉素(Kan)均购自上海生工。

表1 本研究中使用的质粒和菌株Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.3 培养基

LB液体培养基(g/L):胰蛋白胨10,NaCl 10,酵母粉5,pH 7.0,115 ℃灭菌20 min;LB固体培养基:在LB液体培养基中加入2%的琼脂;LB Kanr培养基:在LB培养基灭菌后温度降至60 ℃,加入相应比例硫酸卡那霉素溶液,终浓度为100 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株构建

根据NCBI上公布的E.coliBL21基因组(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM946981.2)设计血红素合成相关酶基因的引物用于基因扩增,如表2所示。

表2 本研究中所用引物Table 2 Sequences of primers used in this study

注:表格中下划线标注表示酶切位点序列,斜体标注表示同源臂序列,粗体标注表示添加的RBS序列。

以pEB质粒为例,用E.coliBL21作为模板,利用引物hemBF和hemBR扩增得到hemB目的片段,用BamH Ⅰ和NotⅠ双酶切pET28a和片段hemB,胶回收后以T4 DNA连接酶在适当酶连体系中连接成新质粒pEB如图2-a,转化至E.coliBL21中验证。同理,gltX、hemA、hemD和hemH基因使用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切。

最终将构建的pEB、pEX、pED和pEH分别转化至表达宿主E.coliBL21中,重组菌依次命名为Eco/pEB、Eco/pEX、Eco/pEA、Eco/pED和Eco/pEH。

表达质粒pEAD则借助CloneEZ PCR试剂盒同源重组完成,以原pED为模板用同源臂引物hemADF和hemADR(为确保hemA和hemD均能正常转录表达,在同源臂引物上引入一个pET28a的RBS序列TAAGGAGGAATCTT)扩增得到含有RBS的hemD,随后用Hind Ⅲ单酶切pEA使其线性化,最后将含有RBS的hemD和线性化的pEA纯化后通过CloneEZ酶在22 ℃温浴30 min后连接得到重组共表达质粒。将上述重组共表达质粒转化至感受态E.coliBL21中,提取质粒并进行双酶切验证,将验证正确的质粒命名为pEAD,质粒构建如图2-b。转化后的新菌株命名为E.co/ pEAD,保存于-80 ℃甘油中。

图2 血红素关键基因重组质粒的构建Fig.2 Recombinant plasmids of important heme genes

1.2.2 重组蛋白表达及SDS-PAGE检测

改进宋艳群等[1]方法,重组菌于37 ℃,200 r/min过夜活化培养后以4%接种量转接至含有Kanr的LB液体培养基中;待菌体的OD值为0.6~0.8时以0.5 mmol/L IPTG于37 ℃、200 r/min的条件诱导4 h;用0.2 mmol/L(pH=7.5)的Tris-HCl缓冲液悬浮菌体;湿菌体与缓冲液的质量体积比为1∶16,60%的功率工作1 s、间歇3 s,超声破碎20 min;1 000 r/min离心15 min,上清液为可溶蛋白,用一定比例的缓冲液充分悬浮沉淀后的溶液即为蛋白包涵体。

1.2.3 ALA浓度检测

参考ZHANG[14]ALA检测方法,以5-氨基乙酰丙酸盐标准品作为标准样品,准确配制浓度为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/L的ALA标准液;将2.0 mL新鲜ALA标准液或待测样品加入到10 mL具塞离心管中,再依次添加1.0 mL乙酸盐缓冲液(pH 4.6)和0.5 mL乙酰丙酮,在沸水浴中加热15 min,待离心管自然冷却至室温,从离心管中取出2 mL反应液,再加入2 mL DMAB显色剂,显色反应30 min,以水做空白参照,在554 nm处测定吸光度(A554)。

1.2.4 血红素卟啉浓度检测

利用荧光法[15]检测血红素和卟啉浓度。取培养后的适量菌体[OD600× mL=8,若菌体的OD600值为0.4,则取20 mL菌液][16]于4 ℃、12 000 r/min离心5 min后得到菌体沉淀,水洗后将菌体重悬转移至1.5 mL琥珀色离心管,离心后去上清;向1.5 mL离心管加入500 μL 20 mmol/L的草酸,于4 ℃暗室过夜静置16 h;在各离心管中加入500 μL 2 mol/L草酸,取一半样品(用于卟啉浓度检测)于常温下反应作为实验对照组,另一半样品(用于卟啉和血红素总浓度检测)于95 ℃水溶中加热30 min,自然冷却后12 000 r/min离心5 min,取200 μL于黑色96孔荧光板,进行荧光值检测(激发波长为400 nm,发射波长为620 nm),两组样品差值即为待测血红素浓度。

1.2.5 环境因素的设置

采用单因素实验,分别设置不同环境因素:温度分别为16、25、30和37 ℃;装液量分别为60、80、100、150和200 mL;外源添加物分别为0.2 mmol/L的FeCl2、谷氨酸(glutamate,Glu)、丙氨酸(alanine,Ala)、甘氨酸(glycine,Gly)和葡萄糖(glucose,Glc)。

2 结果与讨论

2.1 血红素酶基因过表达菌株的构建

在大肠杆菌C5途径中(图1),谷氨酸由谷氨酰t-RNA合成酶(由gltX编码)催化生成谷氨酰-tRNA,后者在谷氨酰-tRNA还原酶(由hemA编码)催化下生成谷氨酸-1-半醛,再经谷氨酸1-半醛-氨基转移酶(由hemL编码)合成ALA,后续经ALA脱水酶、尿卟啉原Ⅲ合成酶和亚铁螯合酶等形成卟啉至终产物血红素[17]。通常,hemA参与的ALA合成是吡咯类化合物合成的限速步骤[18-19],ALA脱水酶(由hemB编码)是ALA合成后的第1个下游酶,尿卟啉原Ⅲ合成酶(由hemD编码)用于催化HMB形成第1个卟啉环,亚铁螯合酶(由hemH编码)[20]则催化终产物血红素的形成。

选取gltX、hemA、hemB、hemD、hemH作该本研究的关键酶基因,进行PCR扩增,并与pET28a载体连接成新质粒,进行双酶切验证试验,结果如图3所示。

(a)3、(b)1、(c)1、(d)1、(e)1:DNA marker;(a)1:pEX双酶切产物;(b)3:pEA双酶切产物;(c)3:pEB双酶切产物;(d)5:pED双酶切产物;(e)3:pEH双酶切产物图3 重组质粒构建的凝胶电泳Fig.3 Construction of recombinant plasmids

各片段大小分别为1 416、1 257、975、741和963 bp,酶切结果与理论相符,测序正确,说明这些血红素酶基因过表达菌株构建成功。将新质粒分别命名为pEX、pEA、pEB、 pED和pEH,转化至E.coliBL21构建成新菌株Eco/pEX、Eco/pEA、Eco/pEB、Eco/pED和Eco/pEH。

2.2 血红素酶基因重组菌的表达及对卟啉合成的影响

将构建的重组菌于0.5 mmol/L IPTG,在37 ℃条件下诱导4 h,5-氨基乙酰丙酸脱水酶、尿卟啉原Ⅲ合成酶、谷氨酰tRNA还原酶、谷氨酰tRNA合成酶和亚铁螯合酶的蛋白表达如图4所示,分析各蛋白分子量分别约为39.45、31.65、50.15、56.95和39.65 ku,大小正确。5-氨基乙酰丙酸脱水酶(由hemB编码)和谷氨酰tRNA合成酶(由gltX编码)诱导后主要以可溶蛋白存在,尿卟啉原Ⅲ合成酶(由hemD编码)和谷氨酰tRNA还原酶(由hemA编码)诱导后主要以包涵体形式存在,亚铁螯合酶(由hemH编码)诱导后则以可溶蛋白和包涵体2种形式并存。

(a)1-protein Marker;2-pEB(-IPTG);3-pEB(+0.5mmol/L IPTG);4-pEB包涵体;5-pET28a(-IPTG);6-pED(-IPTG);7-pED(+0.5 mmol/L IPTG);8-pED包涵体;9-pEA(-IPTG);10-pEA(+0.5 mmol/L IPTG);(b)1-protein marker;2-pEH(-IPTG);3-pEH(+0.5 mmol/L IPTG);4-pEH包涵体;5-pET28a (-IPTG);6-pEX(-IPTG);7-pEX(+0.5 mmol/L IPTG);8-pEX包涵体;9-pEA包涵体;10-protein marker图4 重组蛋白的检测Fig.4 Detection of recombinant proteins

按1.2.4方法处理菌体后检测血红素卟啉,结果如图5所示。hemA、hemB、hemD和hemH对总卟啉(包括重组菌血红素合成途径中产生的尿卟啉、粪卟啉和血红素等)均有一定的促进作用,其中Eco/pEA的产量在无IPTG诱导下血红素浓度最高可达17.01 μmol/L,诱导条件下达14.80 μmol/L,说明hemA对血红素合成的影响最显著,远超过其他基因对血红素合成的影响。hemA是血红素前体ALA合成的关键酶[17],已有研究报道指出,过表达S.srizona的hemAM使ALA产量增加,而E.coli的hemL与S.srizona的hemAM编码的酶协同作用可进一步使ALA产量增加,过表达gltX时会出现ALA产量下降的现象,同时对hemB有转录上调作用[11]。ZHANG等[21]尝试共表达hemAM、hemF和hemL可大幅度提升ALA产量,hemA、hemD和hemL共表达效果次之。

图5 重组菌的卟啉与血红素含量Fig.5 Contents of heme and porphyrin of recombinant strains

2.3 hemA与hemD的共表达及其对卟啉合成的影响

hemA和hemD共表达菌株Eco/pEAD按方法1.2.1构建,其重组质粒的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切产物如图6所示,分别为5 349、2 203 bp,分子量正确,将重组质粒pEAD送至华大测序,序列正确,菌株构建成功。将Eco/pEAD于0.5 mmol/L IPTG 37 ℃下诱导5 h,检测Eco/pEAD蛋白,如图7所示,pEAD中hemA编码的酶有大量包涵体形成而hemD编码的酶并无明显增加,该现象可能由于第2个基因的转录不完全,利用单一转录单元共表达时,难以控制多个目标基因表达水平的一致性[22]。

1-DNA marker;2-pEA双酶切产物;3、4-pEAD双酶切产物图6 重组质粒构建的凝胶电泳Fig.6 Construction of recombinant plasmids

1-pET28a;2-pEAD(-IPTG);3-pEAD(+0.5 mmol/L IPTG);4-pEAD包涵体;5-pEA(-IPTG);6-pEA(+0.5 mmol/L IPTG); 7-pEA包涵体;8-pED(-IPTG);9-pED(+0.5 mmol/L IPTG);10-pED包涵体;11-protein marker图7 Eco/pEAD的目标蛋白检测Fig.7 Target protein detection of Eco/pEAD

Eco/pEAD卟啉和血红素含量如图8所示,最高分别为74.90 μmol/L和22.69 μmol/L,较之高产菌株E.colipEA的卟啉含量76.70 μmol/L和血红素含量26.53 μmol/L,没有起到明显的提升产量的效果,反而略有下降。LIU等[16]提出多基因强制表达时,各基因表达效果会减弱,2个对血红素有利的基因常规共表达不一定会使血红素增产效果叠加,与本研究结果相类似。

对各重组菌的卟啉和血红素含量检测分析,菌体产卟啉和血红素的趋势是基本一致的,血红素产量可以作为体现卟啉总量积累的表征。血红素产量不仅受内源酶的调控,而且受环境因素的影响。从图5、8结果可知,诱导剂可以诱导酶的表达,但是不添加诱导剂时各酶基因对血红素产量提升趋势更显著于是在不添加诱导剂时对血红素产量最高的Eco/pEA进行环境因素分析,同时检测血红素前体物质ALA[23]产量,探讨在不同环境下前体物质ALA积累与终产物血红素产量之间的关联。

图8 Eco/pEAD的血红素与卟啉含量Fig.8 Contents of heme and porphyrin of Eco/pEAD

2.4 环境因素对Eco/pEA的ALA及血红素产量影响

根据2.3结果,选取不添加诱导剂时血红素产量最高的Eco/pEA进行环境因素分析。将Eco/pEA在各个温度下培养5 h后(以OD600为0.6~0.8记为菌体培养的0 h)进行ALA和血红素的检测,结果如图9(a),ALA产量在初期随着温度的升高有上升的趋势,30 ℃时最高为27.64 mg/L,37 ℃时有所下降为23.38 mg/L。血红素产量则随温度增加呈上升趋势,在37 ℃时达到最高26.53 μmol/L。该结果显示ALA积累与血红素产量受温度影响并不一致,30 ℃对产ALA最有利但并不是血红素积累的最佳温度,血红素在37 ℃为最佳温度。

溶氧通过摇瓶装液量控制,Eco/pEA于37 ℃下培养5 h后检测ALA与血红素,结果如图9(b)所示,溶氧环境的改变对ALA积累没有太大的差异,但随着溶氧的减少,血红素产量呈上升趋势,这可能是血红素参与多种呼吸链酶的反应,呼吸作用会对胞内血红素含量产生影响。

血红素蛋白的重组表达中诸如Fe2+、血红素前体ALA以及氯高铁血红素通常作为添加物补充进培养基以促进血红素合成[24-26]。本研究选取FeCl2、Glu、Ala、Gly和Glc作为本研究的外源物添加至培养基中,将Eco/pEA于37 ℃下培养5 h检测各产物。从图9-c的结果中可知,FeCl2、Glu和Glc对ALA和血红素积累都有一定的促进作用,其中Glc的效果最明显,使得血红素产量进一步增长到34.45 μmol/L。

Fe2+作为血红素螯合的金属离子,充足的Fe2+有利于血红素的合成[27]。Glu作为大肠杆菌C5途径合成的前体对血红素积累作用明显,Glc的存在会抑制ALA脱水酶导致ALA和血红素的增加[28]。Ala对血红素的增加原因尚不清楚,有待进一步探究。FeCl2、Glu和Glc对ALA和血红素产量均有促进作用,但是Glu对ALA合成的促进效果最明显,而血红素合成中Glc的促进效果最显著。

(a)-温度;(b)-溶氧;(c)-外源添加物图9 环境因素对Eco/pEA产ALA和血红素产量的影响Fig.9 The influences of environmental factors on ALA and heme production of Eco/pEA

3 结语

大肠杆菌作为常用的基因工程宿主菌株,其卟啉类物质的合成在菌株的生长、代谢和以血红素为辅基酶类的异源表达中具有重要作用。本文通过对大肠杆菌卟啉合成途径的关键酶基因的过表达和共表达,发现hemA基因过表达对总卟啉和血红素的积累有明显的促进作用,而其他基因的过表达以及hemA和hemD的共表达则无明显效果。通过温度、溶氧及外源添加物对卟啉合成前体ALA及终产物血红素产量影响的分析,发现适量的外源Fe2+、Glu和Glc同时提升了ALA和血红素的含量,但温度及溶氧对ALA和血红素的影响并不一致。37 ℃对血红素的积累最有利,而30 ℃时ALA含量最高;溶氧减少时血红素含量上升,而ALA在溶氧条件改变时没有明显的变化规律。在37 ℃、200 mL装液量条件下添加0.2 mmol/L Glc时,Eco/pEA的血红素产量最高,可达34.45 μmol/L,是原始菌株的11.7倍,以上结果表明尽管卟啉合成途径涉及多个关键酶,但它们的过表达在终产物血红素合成中所起的作用明显不同,环境因素对ALA和血红素产量的影响并不总是一致,以上结果为进一步调控大肠杆菌卟啉类物质的合成提供了一定的理论依据。

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