中国南瓜(Cucurbita moschata D.)遗传图谱构建及果实黄酮QTL定位

刘泽发 ，谢 波 ，孙 波 ，孙小武

(1.湖南人文科技学院 湖南娄底 417000； 2.湖南农业大学园艺园林学院长沙 410128； 3.湖南雪峰种业有限公司 湖南邵阳 422000)

作物果实皮色是一个重要育种性状，南瓜果皮颜色、果实形态具有丰富的多样性，大部分可以观赏也可以食用，皮色多样性已成为南瓜育种中一个重要的指标[1]。果实皮色遗传是一个极其复杂的性状，目前果实颜色方面主要是研究不同皮色间的显隐性关系，已有的研究结果表明，有棱丝瓜赤麻果色是一个显性核基因控制的质量性状[2]，甜瓜果皮底色、果肉颜色由单基因控制，黄绿果皮和橘红色果肉为显性性状[3]。相关研究对一些果实颜色相关基因进行了初步定位，丝瓜皮色相关的基因位点Ws被定位在连锁群LG6上[4]。在南瓜果实皮色研究中，向成钢[5]通过对印度南瓜果实颜色的遗传研究认为，南瓜果实皮色白色对其他皮色类型均呈现不同上位性效应，黄色相对绿色表现不完全显性，认为皮色是受核基因控制的质量性状。金丹[6]利用RAPD分子标记技术推测RAPD标记AG-10可能与黄色西葫芦皮色相关。李晓林等[7]以中国南瓜亲本及F1代作为研究对象，通过POD、EST同工酶测定，认为果皮颜色属于偏父本遗传。

黄酮具有清除自由基及抗氧化作用，在防治心脑血管疾病、保肝护肝、抗肿瘤、抗自由基、抗氧化、抗病毒、消炎、镇痛、止咳、平喘等方面有重要作用[8]。南瓜黄酮等方面的研究较少，尤其在资源筛选及评价、遗传分析及分子标记QTL定位方面很少涉及，其研究主要集中在南瓜各部位黄酮含量、黄酮提取方法等方面，有研究认为，南瓜花中的生物总黄酮含量最高[9]。相关研究也表明，不同基因型的蔬菜黄酮含量差异较大[10]，这一发现为通过蔬菜品质育种提高黄酮含量提供了可能。QTL定位研究可以初步确定控制数量性状基因的相对位置和区域，为相关性状的育种提供依据，如大豆耐低磷性状的QTL[11]、棉花纤维品质QTL[12]、小麦千粒重的QTL[13]。南瓜果实皮色和果实外形具有丰富的多样性，开展对南瓜果实相关性状的遗传规律及定位研究，在种内或者种间构建多样的遗传图谱，可以为南瓜QTL精细定位、基因组研究等提供试验基础，对分子标记辅助育种、提高南瓜育种效率具有重要意义。笔者采用RSAP、SRAP、SSR标记等3种标记技术结合6世代群体，分析果实性状与颜色性状相关基因，并进行初步基因定位，成功构建遗传框架图谱，并对控制南瓜生物黄酮QTL进行分析定位，为富黄酮南瓜种质资源创新与新品种选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

由湖南雪峰种业有限公司瓜菜研究室提供中国南瓜材料P1(父本，全黄，短棒形，平均果实长度7.8 cm，生长势弱，节间短，坐果节位低)、P2(母本，全黑，长棒形，平均果实长度17.0 cm，生长势强，节间长，坐果节位高)，2014年春季在湖南娄底和邵阳田间种植，构建6世代群体，即F1(B-5×A-3)、P1(A-3)、P2(B-5)、BC1F1(F1×A-3、F1×B-5)、F2，株行距为 0.6 m×1.5 m，大棚内吊蔓栽培，6月底收获成熟果实。2014年秋季在湖南娄底和邵阳2个大棚种植材料，F2种植112株、BC1F1分别种植 162、139 株，F1、P1和 P2分别种植 20 株，采用随机区组设计，各世代设置3次重复，定植20 d后在植株吊蔓时将植株编号并提取DNA，取植株幼嫩叶片约0.05 g，用改良CTAB法提取DNA[14]。后续试验在湖南人文科技学院农业与生物技术学院实验室进行。定植50 d后，于果实成熟期记录果实性状，试验材料果实特性如图1。

图 1 P1、P2及 F1果实

1.2 方法

1.2.1 南瓜PCR扩增体系及扩增程序 SRAP、RSAP扩增体系与扩增程序参照刘泽发等[15-16]的方法与程序进行。TaqDNA聚合酶、dNTPs等试剂购自上海索莱宝公司，引物由上海生物技术工程有限公司合成。

1.2.2 数据记录及分析 引物筛选时，以扩增条带长度bp差异记录数据，构建连锁图谱时，P1带型记为“A”，P2带型标记为“B”，F1带型标记为“H”，缺少条带标记为“-”。数据整理后使用Excel、Mapmaker 3.0、MapDraw 2.1、Joinmap 4.0、WinQTLCart 2.5 等连锁分析、遗传作图、QTL定位分析，连锁参数临界值设置为LOD=3.0，以最大图距50 cM划分连锁群和排列基准距离，用Mapmaker 3.0中Kosambi函数计算连锁值及连锁距离，作图数据利用连锁作图软件构建遗传连锁图谱，以MapDraw 2.1绘制遗传距离[17]。

形态标记定位，以皮色黄色统计为“A”，黑色统计为“B”，中间型统计为“H”，将全黄性状标记为yf(yellowfull)，与分子标记数据结合进行性状定位，同样的方法，以果实短纺锤型统计为“A”，长棒形统计为“B”，中间型统计为“H”，标记为ls(long stick)，将性状数据与分子标记遗传连锁图谱上的分子标记数据共同分析，并用Mapmaker 3.0软件分析定位。

南瓜黄酮fl(flavonoids)QTL定位采用微波辅助法[18]提取并测定全部F2单株果实及父本、母本、F1植株各5个果实生物总黄酮含量，结果取平均值，数据结果用SPSS Statisics统计软件进行正态分布符合度检测。用WinQTLCart 2.5结合构建好的遗传图谱进行分析，采用复合区间作图(CIM)法，设置步长为2.0 cM进行全基因组扫描分析，以LOD＞2.5为阈值检测与南瓜果实黄酮性状相关的QTL在连锁群上的位置。

1.2.3 引物来源及筛选 试验中所用部分引物来源于南瓜SSR引物，其中美洲南瓜SSR 193对，中国南瓜SSR 307对[19-21]，其余引物为RSAP(119对)和SRAP引物(24对)。

2 结果与分析

2.1 作图群体及果实形态标记遗传分析

通过对田间F2代群体果实颜色的调查，果实颜色全黄株数为32株，杂合型为55株，全黑为13株，经卡平方检验，果实全黄分离比与期望值(1∶2∶1)差异极显著(表1)。说明南瓜果实颜色全黄性状为具有一定偏分离的偏向父本型的隐性性状，暂命名为yf(yellowfull)基因。调查统计发现，果实长度接近母本型单株数为18株，接近父本型单株数为32株，杂合型为50株，分离比符合1∶2∶1孟德尔遗传规律(表1)。说明长棒形果实性状为单基因控制的隐性性状，暂命名为ls(longstick)。

表1 果实形态标记遗传分离情况

2.2 引物筛选

所用引物包括美洲南瓜SSR引物(193对)，中国南瓜SSR引物(114对)，其余部分引物为RSAP(119对)和SRAP引物(24对)。以亲本为模板，初步筛选出206对具有多态性的引物(SSR标记101对、SRAP标记19对、RSAP标记86对)。图2为多态性 Sm104引物(TGAACTGGGAGAGAG-GTTTGTGTCAGCTTCCTCAGTAGGG)在亲本及100株F2代群体中的电泳带型情况。

2.3 南瓜遗传图谱构建及果实性状定位

筛选分离比基本符合(1∶2∶1)的 93个标记，数据通过Mapmaker 3.0进行分析，有4个标记偏分离严重不能上图，累计上图87个分子标记，2个形态标记，包含18个连锁群，图谱覆盖基因组1 038.9 cM，标记间平均遗传距离为11.67 cM。最长的连锁群为LGp11，遗传总距离为125.6 cM，共9个分子标记，最短的连锁群LGp18有2个分子标记，遗传距离为0.5 cM。

yf基因被定位到连锁群LGp2的末端，连锁群有4个分子标记，yf两侧连锁比较紧密的分子标记为rs10-13和rs10-15，连锁遗传距离分别为9.9 cM和10.4 cM。ls基因被定位到LGp7连锁群上，该连锁群共有5个分子标记，与分子标记e2m2连锁遗传距离为3.7 cM，与另一侧分子标记Sm87遗传距离较远，为27.9 cM(图3)。

2.4 南瓜果实生物黄酮fl-QTL定位及遗传效应分析

2.4.1 父本、母本、F1和F2黄酮含量相关性状表现南瓜果实生物黄酮含量在双亲间的表现差异极显著(表2)，F2代群体中果实黄酮含量在1.35～38.64 mg·g-1之间，用SPSS 7.0软件对果实黄酮含量频率进行正态分布检测，峰度为-0.93，偏度为-0.4，峰度、偏度均少于1.0，其频率分布图与正态分布曲线基本吻合，说明黄酮果实含量为一个连续变化且没有明显按照比例分离的表型，具有数量性状遗传分布特征(图4)。

表2 亲本与F2黄酮含量

图4 南瓜F2代果实黄酮含量正态分布

2.4.2 南瓜黄酮含量性状的QTL定位及遗传效应分析 利用WinQTLCart 2.5，阈值设置为3.0 LOD(约13.82 LR)进行复合区间全基因组扫描南瓜黄酮含量QTL，共检测到3个与南瓜黄酮含量相关的QTL，均位于LGp13连锁群上(大于2.5 cM认定存在 QTL)，分别命名为 flQ1、flQ2和 flQ3。在LGp13上flQ1遗传距离为 6.21 cM，位于 Sp8_12～Sp_129区段之间，与分子标记Sp129距离最短为0.5 cM，flQ2的遗传距离为13.91 cM，位于Rs_4-12～rs1_10(rs3_10)之间，与分子标记 rs1_10(rs3_10)的距离最短为 0.5 cM，flQ3的遗传距离为39.11 cM，位于 Sm130～rs5_12之间，与分子标记Sm130的距离最短为14.2 cM，flQ1、flQ2和flQ3的置信区间变化分别为3.2～6.6 cM、10.9～14.9 cM和32.7～52.7 cM，QTL贡献率分别为 46.32%、39.75%和 17.2%(表 3、图 5、图 6)。

表3 QTLs在LGp13连锁群上的分布

图5 南瓜果实黄酮含量性状QTL在LGp13连锁群上的定位

图6 fl-QTL作图

3 讨论

南瓜在葫芦科作物中具有“多样性之最”的美誉，南瓜属(Cucurbita)果实形状、颜色等遗传性状方面丰富多彩，另外具有多样的食用、加工方式和宝贵的医疗保健价值，在蔬菜、瓜类植物中其多样性之表现是罕见的。南瓜属中西葫芦果实颜色绿色对白色为显性，是质量性状，受1对核基因控制，分离世代的绿色果实颜色深浅程度不同，可能受到微效多基因的修饰作用[22]。甜瓜果皮底色和果肉颜色由单基因控制，黄绿果皮和橘红色果肉为显性性状[3]，番茄果色性状受核基因控制，而色素含量遗传除受核基因控制外还可能存在胞质效应[23-24]。笔者对南瓜全黄(yf)基因进行遗传特性及QTL定位研究，认为yf为偏父本的隐性性状，可以解释南瓜果实颜色中全黄颜色南瓜品种和资源偏少，灰色、黑色和具有深色条底色的南瓜资源较多，试验受育种资源限制，未开展红色、黑色果实遗传研究，但可以为后续的关于南瓜果实颜色遗传及颜色多样性原因提供试验依据。另外，笔者认为南瓜长棒果实(ls)为隐性遗传，也为南瓜果实形状育种提供依据。

南瓜中富含黄酮等功能成分，另外，南瓜中胡萝卜素、戊聚糖、果胶、甘露醇、葫芦巴碱等含量丰富，其功能成分对多种疾病有疗效，南瓜多糖是预防糖尿病的活性成分[25]，在南瓜果肉中，其肌醇含量达到16.44 mg·g-1[26]，黄酮是一种良好的抗氧化剂，在南瓜花中含量达到3.04%，叶中的含量为2.51%[27]。目前关于南瓜富肌醇资源筛选与评价及富肌醇品种选育[26]、南瓜多糖提取纯化及抗氧化[28]、高铬南瓜资源筛选、品种选育及南瓜铬形态及利用已有系统研究[29-30]，但是在南瓜富黄酮等方面研究较少，尤其在资源筛选及评价、遗传分析及分子标记QTL定位方面很少涉及。其研究主要集中在南瓜各部位黄酮含量、黄酮提取方法等方面，有研究认为南瓜花中的生物总黄酮含量最高[9]，由于南瓜花在南瓜整个生物产量中占的比重很少等原因，难以形成大的加工产业链。

4 结论

通过对田间F2代群体果实颜色的调查，南瓜果实颜色全黄为具有一定偏分离的偏向父本型的隐性性状，暂命名为yf基因。长棒形果实相对短棒形果实为单基因控制的隐性性状，暂命名为ls基因。

以87个标记连同ls、yf数据通过Mapmaker 3.0进行分析，共构建18个群体，图谱覆盖基因组1 038.9 cM，标记间平均遗传距离为11.67 cM，最长的连锁群为LGp11，遗传总距离为125.6 cM，共9个分子标记。yf基因定位到连锁群LGp2，连锁群有4个分子标记，与yf连锁比较紧密的分子标记为rs10-13和rs10-15，连锁遗传距离分别为9.9 cM和10.4 cM。ls基因定位到LGp7连锁群上，该群共有5个分子标记，与分子标记e2m2连锁遗传距离为3.7 cM，与另一侧分子标记Sm87遗传距离较远，为27.9 cM。

南瓜果实生物黄酮含量为一个连续变化的分布且没有明显的按照比例分离的表型，具有数量性状遗传分布特征。共检测到3个与南瓜黄酮含量相关的QTL，均位于LGp13连锁群上，分别命名为flQ1、flQ2和flQ3。flQ1、flQ2和flQ3的置信区间变化分别为 3.2～6.6 cM、10.9～14.9 cM 和 32.7～52.7 cM，QTL贡献率分别为46.32%、39.75%和17.2%。笔者开展南瓜果实黄酮QTL定位研究，在LGp13遗传连锁群初步定位了3个南瓜果实黄酮QTL位点(flQ1、flQ2和flQ3)，为开展南瓜果实黄酮数量性状精细定位提供依据，为富黄酮南瓜种质资源创新及新品种选育奠定理论基础。