基于非线性动力学方法研究钙离子在针刺神经电信号传导中的作用

陈静子,刘阳阳,刘喆,郭义,郭永明

(1.天津市南开医院,天津300100;2.天津中医药大学,天津301617;3.浙江中医药大学第三附属医院,杭州310005)

针灸学作为中医学科体系中最具特色和优势的学科,以其独特的理论体系和治疗方法丰富了世界医药卫生学知识。对针灸作用原理的研究一直是学者们多年来的研究重点,其中针刺信息的传导更是针灸研究中关键科学问题之一。以往对于针刺信息的研究大多是从形态学角度研究针刺信息的传导媒介,而从化学角度进行的研究较少。既往研究表明,化学物质的传导是生物体内信息传导的重要途径之一,如神经动作电位的传导机理、激素作用原理的阐明等。因此,从化学角度研究针刺信息的传导是针刺信息研究的重要途径之一。在众多的化学物质中,钙离子(Ca2+)在许多生命活动中发挥着重要作用。在神经细胞迁移和轴突导向中,Ca2+也是一个很重要的信号分子[1],由Ca2+参与的细胞信号系统被认为是神经系统整合的分子机制之一[2],且Ca2+与经络活动具有非常密切的关系,是构成经络活动的关键因素之一。本课题组前期工作中,在不同动物、不同模型上均观察到改变针刺部位的Ca2+浓度可以使针效丧失或减弱,结果具有一定的普遍性[3-6]。针刺作为一种微创性物理刺激作用于人体时,最迅速、直接的反应就是对神经系统的影响。在针刺过程中,神经起着不可或缺的作用,其中外周神经是针刺即刻有效信号的重要传入途径之一,阻滞针刺穴位神经对针刺效应有明显的抑制作用[7-8]。穴位作为针刺信号的起始部位,针刺信号通过穴位局部的感受器及神经末梢的兴奋传入中枢神经系统。针感的产生可能有两方面的原因,一是针刺直接机械作用于神经末梢装置;二是针刺引起穴位组织中化学成分的改变或组织细胞颗粒释放生物活性物质作用于神经末梢装置而将针刺刺激信号转换为神经冲动[9-10]。足三里穴作为临床常用穴位,针刺足三里穴时,可在人和动物体内产生电信号或使电信号发生变化,相关研究已取得一定的结果[11-12]。因此,本文以足三里穴作为刺激点,以神经反应作为切入点进行研究,采用钙离子络合剂[乙二醇双乙胺醚四乙酸(EGTA)溶液]穴位注射络合足三里穴区Ca2+,分别记录穴位注射前及穴位注射后即刻、7 min、14 min、21 min、28min时针刺足三里穴外周传入通路脊髓背根神经细束的电信号,并应用非线性时间序列和小波能量熵等方法分析,研究Ca2+对针刺神经电信号的影响,为揭示Ca2+在针刺信号传导过程中的作用及针效产生的始动机制进一步提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用清洁级雄性 SD大鼠,体重为180～210g,许可证号[SCXK(京)2007-0001]。

1.2 实验方法

大鼠麻醉(20%乌拉坦,1.5g/kg腹腔麻醉)后,取俯卧位固定,沿后背正中线剪开T13-L6段对应的背部皮肤,分离去除皮下筋膜,剔除T13-L5椎体两侧附着的竖脊肌,用骨钳剔除T13-L5脊椎棘突和横突,暴露出脊髓。在解剖显微镜下剥离硬脊膜,以皮瓣缝合成油槽,用37℃的石腊油覆盖保温、防干燥。镜下分离L4脊髓背根神经并在近心端剪断,分离至感受野的敏感点在足三里穴位区的神经细束,将其搭放在双极铂金丝记录电极上,记录此刻的神经细束放电,行平补平泻提插法,幅度约 0.3cm,频率120次/min,操作时间为 2min,作为穴位药物注射后放电的对照。实验组穴位注射0.1mol/L EGTA 5μL络合足三里穴区Ca2+;对照组穴位注射0.05 mol/L Ca2+-EGTA对照液5 μL。同上述方法记录穴位注射前及穴位注射后即刻(YH0)、7min(YH7)、14 min(YH14)、21 min(YH21)、28 min(YH28)时神经细束的放电情况。传入单位放电经MP150生物信号采集系统采集记录并进行分析处理。利用非线性时间序列分析方法、小波能量熵分析法、峰峰间期等方法对采集的数据进行分析。实验设计如图1所示。

图1 实验设计图

1.3 数据记录

实验整体记录了23组有效实验数据,其中实验组17组,对照组6组。采样频率为4kHz,在分析中每个时间段截取60s,即240万采样点进行分析。因为实验中采集的信号——脊髓背角神经束为实验操作者随机剥离,是多个神经元放电的累加,非单神经元采集的放电,故我们首先需要将几个神经元的累加信号进行分离,即信号类选算法(sorting)。

1.4 分析方法

①首先对针刺峰放电序列进行基本特征分析,统计每个定长时间段中放电个数,比较穴位注射前后放电个数变化情况;统计每个时间段峰放电序列放电幅值的平均值,比较穴位注射前后的变化情况;统计每个时间段峰峰间期(interspike intervals, ISI)序列的变异系数,同样进行对比。②其次对针刺电信号进行非线性特征提取,计算原始电信号的功率谱和ISI序列的Lyapunov指数,提取ISI序列的关联维数以及分析放电脉冲序列的LZ复杂度,比较穴位注射前后峰放电的变化情况。③再对针刺电信号进行小波能量熵分析,比较穴位注射前后各时间段熵值变化情况,说明Ca2+浓度降低对于针刺电信号的影响。

1.5 统计学方法

所有数据采用SPSS17.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用两独立样本秩和检验,组内不同时段比较采用配对样本秩和检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

实验结果中YQ表示穴位注射药物前;YH0表示穴位注射后即刻;YH7表示穴位注射后第7分钟;YH14表示穴位注射后第14分钟;YH21表示穴位注射后第21分钟;YH28表示穴位注射后第28分钟。

2.1 基础统计分析

2.1.1 放电频率统计分析

由表1可见,实验组各时间段(YH0、YH21、YH28)的放电频率均降低,与同组YQ比较差异均具有统计学意义(P＜0.01);对照组各时间段(YH14、YH21、YH28)的放电频率增高,与同组YQ比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。实验组YH21、YH28的放电频率与对照组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

2.1.2 波形幅值统计分析

由表2可见,实验组YH7、YH14的放电波幅均降低,与同组YQ比较差异均具有统计学意义(P＜0.05);实验组YH14的放电波幅与同组YH0比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。对照组YH21的放电波幅增高,与同组YQ比较差异具有统计学意义(P＜0.05);对照组YH28的放电波幅与同组YH0比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。实验组各时间段(YH0、YH7、YH14、YH21、YH28)的放电波幅与对照组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 两组各时间段放电频率比较(±s)

表1 两组各时间段放电频率比较(±s)

注:与同组YQ比较1)P＜0.01,2)P＜0.05;与对照组比较3)P＜0.05

组别nYQ YH0YH7YH14YH21YH28实验组58917.53±596.05510.88±292.121)691.82±600.20586.35±369.46448.06±268.501)3)488.41±390.331)3)对照组59603.67±294.83718.00±395.99672.33±273.34 763.83±250.622)837.33±424.782)910.33±480.782)

表2 两组各时间段放电波幅比较(±s)

表2 两组各时间段放电波幅比较(±s)

注:与同组YQ比较1)P＜0.01,2)P＜0.05;与对照组比较3)P＜0.05

组别nYQYH0YH7YH14YH21YH28实验组580.16±0.150.13±0.103)0.09±0.031)3)0.07±0.021)2)3)0.09±0.063)0.07±0.053)对照组590.22±0.080.24±0.090.25±0.120.27±0.140.30±0.181)0.31±0.222)

2.1.3 ISI统计分析

ISI序列是神经电信号最基本的特征之一,生物学家认为其携带着生物信息的主要元素,神经科学学者将ISI序列作为研究神经信息编码的基本方法。为显示两组各时间段ISI的方差系数(coefficientof variation,CV)均值变化情况,对样本进行归一化,得到如图 2所示的 CV变化趋势。可以看出,实验组 YQ的CV与注射后初始阶段基本相同,后期ISI变异性变大。图3为对照组各时间段CV变化趋势,可见各时间段的变异系数处于一个极小的变化范围,与实验组有明显不同。

图2 实验组穴位注射前后各时间段ISI序列CV均值

图3 对照组穴位注射前后各时间段ISI序列CV均值

2.2 针刺电信号的非线性动力学分析

2.2.1 功率谱

对原始针刺电信号进行功率谱分析,它是从能量的角度提取信号的频率信息。周期运动的功率谱是分立的、离散的,对应于尖峰;拟周期运动的功率谱包括各种频率,对应于有限数目的峰值,非周期运动的功率谱是连续的,故功率谱分析成为观测混沌的重要方法。对穴位注射前后不同时段数据进行功率谱计算,也得到了上面所述的现象,出现了连续峰值,具有混沌的特征。

图4为实验组17组穴位注射EGTA溶液前后各时间段功率谱的均值,加粗红线代表穴位Ca2+浓度正常时(YQ)的针刺电信号功率谱。可以看到EGTA络合穴区Ca2+后,针刺电信号的功率谱在高频部分升高。图5为对照组各时间段功率谱的均值,加粗红线同样代表YQ这一时段的功率谱,可以看到在频率＞5000 Hz的部分与实验组不同,未显示随时间先升后降的趋势。

图4 实验组穴位注射前后各时间段功率谱比较图

图5 对照组穴位注射前后各时间段功率谱比较图

2.2.2 关联维数分析

应用关联维数D2提取两组穴位注射前后各时间段针刺足三里穴脊髓背根电信号的分形混沌特征,维数相对越大,系统相对越复杂。随着时间的流逝,信息损失的速率越快,产生的新信息越多。

由图6可见,实验组穴位注射前ISI序列的关联维数小于穴位注射后ISI序列的关联维数,有一个递增的趋势,而后关联维数又递减到穴位注射前水平。图7为对照组各时间段ISI序列关联维数,变化较大,未呈现类似实验组受Ca2+浓度变化产生的变化规律。

图6 实验组穴位注射前后各时间段ISI序列关联维数均值

图7 对照组穴位注射前后各时间段ISI序列关联维数均值

2.2.3 Lyapunov指数分析

通过求取Lyapunov指数来判别ISI序列是否为随机的,Lyapunov指数刻画了系统对初始条件的敏感依赖性,即在相空间中具有近乎相同的初始状态的轨线以指数增长的方式相互分离的性质,初值敏感性使混沌系统呈现出许多看似与随机系统相同的长期特性,但只有在混沌的系统当中才能观察到正的Lyapunov指数,随机信号的Lyapunov指数为零。

图8为实验组各时间段ISI序列Lyapunov指数归一化后的均值变化情况,有一个先降低后恢复的过程,YQ段Lyapunov指数高于YH段且后期未恢复到YQ水平。图9为对照组各时间段ISI序列Lyapunov指数,该组未呈现实验组的变化趋势。

2.3 针刺电信号的小波信息熵分析

在信息论中,熵表示每个符号所提供的平均信息量和信源的平均不确定性,它能提供关于信号潜在的动态过程的有用信息。事实上,对于一个单一频率的周期信号,除了包含这个典型信号频率的小波尺度,所有的其他小波系数几乎都是零。对于这个特殊的尺度,小波系数将接近于1,而此时信号的熵值将接近于0或者是一个很小的值。相反,由一个完全无序的过程生成的信号(例如随机信号),在所有的频段上都有小波系数,而且数值大小并无明显差别,此时信号的熵值将接近于1;同时,信号的概率分布越接近这种无序的分布,其熵值也就越大,信号熵值的大小反映了概率分布的均匀性。如果把小波变换的系数矩阵处理成一个概率分布序列,由它计算得到的熵值就反映了这个系数矩阵的稀疏程度,也就是信号概率分布的有序程度,这种熵就称作小波熵。因为各样本数据之间小波能量熵差异较大,为了进行比较,同上做归一化处理。

由图10可见,实验组穴位注射EGTA前脊髓背根针刺电信号的小波能量熵明显高于注射后。图11为对照组各时间段平均小波能量熵,可以看到其小波能量熵或处于基本不变的趋势或是增加,与实验组呈明显相反的变化趋势,也说明了Ca2+浓度减低对于针刺电信号的影响。

图8 实验组穴位注射前后各时间段ISI序列Lyapunov指数均值

图9 对照组穴位注射前后各时间段ISI序列Lyapunov指数均值

图10 实验组穴位注射前后各时间段ISI序列小波能量熵均值

图11 对照组穴位注射前后各时间段ISI序列小波能量熵均值

3 讨论

针刺电信息的传入方式分为两种,一种是经神经纤维直接向中枢传递;另一种是基于神经-化学接力联动假说[13]。针刺穴位后,针刺信息由外周传入道路进入中枢有关各级脑部,经中枢整合调制后,通过传出途径对脏腑器官的活动和痛反应进行调节和控制[14]。已有实验证明,由外周传入神经通路传入的针刺信息,通过各级中枢作用后转换为传出神经冲动,其神经冲动沿脊髓背外侧索下行至有关节段,对脊髓背角、中间外侧角及前角神经元发生作用,作用后的神经冲动再沿相应的躯体运动神经或植物神经传至各自的效应器,引起其功能活动的各种变化。针刺穴位后可能引起多种反应,通过多种途径来产生针刺效应,而Ca2+在针刺效应的信息传导中起到关键作用,可能是针刺效应产生的一个重要环节。既往研究结果表明,在神经细胞迁移和轴突导向中Ca2+也是一个很重要的信号分子[1],由Ca2+参与的细胞信号系统被认为是神经系统整合的分子机制之一[2],且Ca2+与经络活动具有非常密切的关系,是构成经络活动的关键因素之一。大鼠脑缺血后,缺血区细胞外游离Ca2+很快流入细胞内,脑缺血后20min已形成细胞内钙超载。现代研究证明,神经元内钙超载是导致神经元坏死的关键因素[15]。经手十二井穴点刺放血法治疗的大鼠,从针刺后第8分钟就开始明显抑制细胞外游离Ca2+的内流,其趋势与时间呈正相关,至第20分钟细胞内钙超载已有所缓解。所以,脑缺血超早期应用手十二井穴点刺放血法进行干预可快速起效,起到调节缺血区脑细胞内外游离Ca2+浓度,有效抑制神经元内钙超载,保护脑细胞功能的作用[16]。目前许多研究也表明,针刺可在机体自稳机制下,在生理功能最大调节极限范围内,调节Ca2+活性的生理浓度,使其趋于平衡,尽早促进疾病由病理状态向正常生理状态转化,从而达到扶正祛邪、以平为期的目的[17-18]。针刺刺激的初始应答部位主要是穴位局部,同时穴位局部又是针刺的物理信息向生物有效信息转换的初始部位,针刺信息的整个转化过程又在穴位处被放大[19],能够对临床后续针刺效应发挥重要作用。因此,从穴位局部入手,研究针刺效应的初始动力学调控机制,将有助于揭示针刺作用原理及机制。本课题组前期研究工作表明,Ca2+与肥大细胞都是针效产生的关键因素[20-21]。郭义等[22]发现穴处的Ca元素可能存在富集;针刺可引起穴位及经脉线上Ca2+浓度变化[23-25]。裴莹等[26]采用EGTA络合足三里穴区Ca2+后,采用光镜观察穴区肥大细胞的形态学变化,研究在针效产生中钙离子与肥大细胞两者相互作用的关系,结果显示机体在胃损伤状态下,针刺能够促进足三里穴位周围的肥大细胞脱颗粒。络合足三里穴区Ca2+后,针刺不能对机体的穴区皮肤、肌肉处的肥大细胞脱颗粒。且络合穴区Ca2+时的EGTA浓度越高,针刺后机体穴区皮肤、肌肉处脱颗粒的肥大细胞数量越少,同时肥大细胞脱颗粒率越低。在针刺过程中,机体穴位处受针刺刺激后,针刺局部可能会产生类似炎性反应,穴位结缔组织牵张释放Ca2+等化学物质,Ca2+浓度升高,激活肥大细胞,促使肥大细胞脱颗粒,释放组胺等炎性介质,并使毛细血管扩张,通透性增加而引起神经、免疫等细胞反应,Ca2+等化学物质循经传送等一系列化学反应。另外,我们知道Ca2+与神经细胞之间关系密切,Ca2+可以引起神经冲动,能有效调控突触前和突触后的调节机制,具有可控制突触后离子通道的功能和逆行抑制神经递质释放机制的双重调节机制[27-29]。EGTA是一种氨羧配位剂,可以与金属离子形成配合物,它与Ca结合后发生构象改变,形成稳定的EGTA钙配合物。因此,本研究实验组以EGTA穴位注射络合足三里穴区Ca2+,对照组以Ca2+-EGTA络合液作为对照液,通过观察两组穴位注射前后各时间段针刺电信号的变化,研究Ca2+对针刺神经电信号的影响特征和规律,揭示Ca2+在针刺信号传导过程中的作用,为针效产生的始动机制进一步提供实验依据。应用生物电工学的部分分析方法对针刺电信号峰放电序列进行基本特征分析、非线性特征提取和小波能量熵分析,比较穴位注射前后各时间段数值的变化情况,结果提示EGTA溶液络合足三里穴区Ca2+能够明显降低支配该穴区的脊髓背根神经细束放电频率和波幅。说明Ca2+在针刺神经电信号传导过程中起着重要作用。络合足三里穴区Ca2+后再行针刺,支配该穴区的脊髓背根神经细束放电频率、波形幅值,及非线性分析结果等都与对照组存在明显区别。本研究结果再次证明了穴区Ca2+浓度是针效产生的关键因素,是经络活动的重要物质基础,提示神经细胞、Ca2+与针刺之间的信号传递可能是针效产生始动机制的主要环节之一,这种信号传递的过程可以开启神经-体液的针刺信号转导、传导,经中枢整合后激活神经-内分泌-免疫系统复杂网络,从而作用于效应器官并最终产生针刺效应。

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