玻璃化深低温法与去细胞光氧化技术制备同种异体小动脉体内性能比较

黄磊　匡锋　赖轶权

【摘要】 目的：通過兔异体颈动脉旁路移植模型，对玻璃化深低温及去细胞光氧化交联处理的兔颈动脉进行体内性能比较，评价两种血管作为临床异体小血管替代物的可行性。方法：将36只SPF级纯种兔随机分成两组，分别予以玻璃化深低温处理的兔颈动脉及去细胞光氧化处理的兔颈动脉行异体颈动脉移植。实验动物分别饲养观察1周、2周和4周后，观察移植血管的通畅情况及内膜增生情况。结果：超声检查发现术后4周去细胞光氧化组的累计通畅率显著高于玻璃化深低温组（P<0.05）。HE染色显示玻璃化深低温组术后免疫反应表现比较严重。去细胞光氧化组术后内皮细胞则生长良好，炎性细胞浸润少。Ⅷ因子染色显示，术后4周玻璃化深低温处理组内皮细胞有不同程度的破坏；而去细胞结合光氧化组内皮生长良好。通过图像分析发现，移植后1周两组血管内/中膜比差异无统计秀而意义（P>0.05），术后2周及4周内膜两组血管内/中膜比差异有统计学意义（P<0.05）。结论：体内性能方面，去细胞光氧化技术制备同种异体小动脉生物稳定性、抗血栓性及内膜增生情况均要优于玻璃化深低温处理的异体兔颈动脉，但同样也存在瘤样扩张，内膜增生等不足。

【关键词】 去细胞光氧化； 玻璃化深低温； 内膜增生； 异体小动脉

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.24.001 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2018）24-000-04

Comparison of in Vivo Performance of Small-diameterallogenic Arterioles Treated with Decellularization Associated with Photo-oxidation and Cryopreservation/HUANG Lei，KUANG Feng，LAI Yiquan，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（24）：-4

【Abstract】 Objective：To evaluate the feasibility of an alternative source of allogeneic arterioles in coronary artery bypass grafting，we build a model of rabbit allogeneic carotid bypass grafting and compared the in vivo performance of rabbit carotid arteries treated with decellularization associated with photo-oxidation and cryopreservation.Method：A total of 36 SPF purebred rabbits were randomly divided into two groups and separately given carotid bypass surgery with small-diameter allogenic arterioles treated with decellularization associated with photo-oxidation and cryopreservation.The experimental animals were reared for 1 week， 2 weeks and 4 weeks.the hemodynamics and patency of graft vessels were observed through transvascular ultrasound and the intimal hyperplasia of the grafts were observed.Result：Vascular ultrasound examinations revealed that the cumulative patency rate of decellularization associated with photo-oxidation group was significantly higher than that of cryopreservation group（P<0.05）.HE staining showed that the endothelial cells in the cryopreservation group had different degrees of shedding and hyperplasia，thrombosis in the lumen， and the immune response was much more severe.While the endothelial cells grow more well in the decellularization associated with photo-oxidation group with less thrombus formation and less inflammatory cell infiltration at the 4th week after surgery.Ⅷ factor staining showed that endothelial cells were disrupted and disorganized in the cryopreservation group while endothelial growth was much better in the ecellularization associated with photo-oxidation group 4 weeks after surgery.The image analysis system showed that there was no significant difference in intima/media ratio after the first week of bypass surgery （P>0.05），but significant difference began to occur between the two groups at 2 and 4 weeks postoperatively （P<0.05）.Conclusion：In terms of in vivo performances，the biological stability，antithromboticity，and intimal hyperplasia of rabbit allograft in the decellularization associated with photo-oxidation group were all superior to those of cryopreservation group，but there are also tumor-like expansion，intimal hyperplasia and other deficiencies existing for us to modify.

【Key words】 Decellularization associated with photo-oxidation； Cryopreservation； Intimal hyperplasia； Allogeneic arteriole

First-authors address：Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen 518000，China

包括冠心病（CHD）和外周动脉疾病（PAD）在内的闭塞性动脉疾病，是导致人类意外死亡的主要原因之一，预计至2030年该类疾病导致的全球死亡率将上升为2330万[1]。对于闭塞性动脉疾病，目前的血运重建技术主要包括血管成形、支架植入和手术搭桥三种。而手术搭桥的桥血管来源方面，自体血管仍是小口径血管的“金标准”移植物[2]，目前临床上比较常用的有大隐静脉、胸廓内动脉、桡动脉等。然而获取这一类血管往往需要进行额外的手术操作，并且所截取的血管往往无法达到临床使用的要求。人工合成的血管移植物是自体血管的有效替代物，目前该类人工血管已经广泛用于大、中等直径的动脉（如颈动脉或股总动脉）的手术操作，虽取得了令人满意的长期结果，但当应用于小直径血管时，如冠状动脉和膝关节以下的动脉时，远期通畅率远不能达到临床要求[3]。考虑到目前的血管旁路管道的局限性，具有生长、重塑和体内修复能力的异体来源的小血管，为血管手术的未来提供了一种潜在的解决方案。本实验通过研究比较玻璃化深低温法、去细胞光氧化法这两种技术处理后的异体小血管，对比两者在组织结构及抗原性方面的变化，以期为同种异体小血管移植的临床应用提供一种新的思路。

1 资料与方法

1.1 实验动物及材料

1.1.1 实验动物及分组 36只SPF级纯种兔，雌雄不限，年龄6～12个月，体重1.5～2.5 kg。由厦门大学医学实验中心提供。采用随机数字法，将动物随机分成2组，玻璃化深低温处理组（n=18）及去细胞光氧化组（n=18）；分别采用玻璃化深低温处理的异体兔颈动脉及去细胞光氧化处理的异体兔颈动脉行移植搭桥。

1.1.2 血管预处理 去细胞光氧化处理兔颈动脉：依据前期实验中所取得的最佳去细胞过氧化方案及玻璃化深低温保存方案[4]，玻璃化深低温处理的兔颈动脉置于液氮中保存，2周后40℃水浴复温，平衡液洗脱后备用。经去细胞处理的兔颈动脉置无菌PBS液中，充分冲洗脱色后备用。

1.2 方法

实验用兔术前禁食4 h，肝素200 U/kg经耳缘静脉注射，3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔内注射麻醉。麻醉成功后，仰卧位固定于手术台，刮净术区皮肤，络合碘消毒，铺盖无菌巾。颈部正中切开皮肤，游离皮下及各肌層，沿气管分离右侧颈总动脉，远、近心端各置血管夹，两夹之间相距1.5 cm左右，切除其间动脉。取相应各组移植血管，裁剪成相应长度，予9-0无创缝线行连续端端缝合，手术完毕后逐层缝合各组织。动物苏醒后常规肌注青霉素20万单位/只（1次/d）共3 d，饲料用混合饲料，术后密切观察。

1.3 观察指标及评价标准

1.3.1 多普勒血管彩超检查 分别于术后1、2及4周采用3%戊巴比妥钠30 mg/kg行腹腔注射麻醉实验兔。经HPsonos4500型超声成像探头（频率10 MHz）检测移植血管通畅情况。如管腔内无实性低回声区，透声好，血流频谱呈动脉频谱，提示移植血管管腔通常；而局部出现实性回声区提示移植血管内血栓形成，血流信号消失提示移植血管闭塞。明确实验兔颈动脉移植血管通畅程度后，于耳缘静脉内注射肝素抗凝（3 mg/kg），经原切口取出移植兔颈动脉，沿长轴纵行剪开移植血管，肉眼观察大体形态；然后剪取部分血管组织，置入10%福尔马林内保存。分别进行下述指标的对比检测。

1.3.2 大体观 各组标本取出后，观察管腔有无血栓、管壁有无明显增厚，变性，血管的大体形态（柔软度、与周围组织的粘连程度、钙化等）。

1.3.3 光镜观察 每组取一小块血管片，10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片，苏木素-伊红染色及弹力纤维染色后行光镜观察。

1.3.4 Ⅷ因子染色 通过Ⅷ因子染色检测兔颈动脉血管腔面是否有内皮细胞生长，标本常规脱蜡和水化后按试剂盒介绍的标准程序进行第一、二抗体染色后置显微镜下观察。

1.3.5 图像分析系统观察 参照Jacobs等[5]对胞核阳性标本的判定方法，从每张染色片上随机选取5～7个视野，VIDAS图像分析系统（德国欧波同公司）光镜下按统一放大倍数（10×40倍）进行分析。在弹力纤维染色结果中计算内膜中膜厚度比代表增殖情况。

1.4 统计学处理

所有统计由统计软件SPSS 13.0完成，计量资料以（x±s）表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 手术及动物存活情况

术中及术后均无实验动物死亡，所有存活动物无偏瘫、头颈歪曲，颈动脉搏动良好；两组术后均有移植血管出现不同程度瘤样扩张的现象，玻璃化深低温组3例，去细胞光氧化组1例。术后1周，2周及4周沿原切口显露双侧颈动脉未完全堵塞的移植血管可见搏动。去细胞光氧化组无闭塞、破裂情况，于远端吻合口处切断血管可见血液喷出，玻璃化深低温组术后4周两根移植血管于远端吻合口处切断后无血液喷出，提示完全堵塞。

2.2 超声检查

分别于术后1周，2周及第4周随机抽取6只实验动物行移植段血管超声检测，见图1A，统计术后4周累计通畅率。检测标准：血管管腔内局部发现实性低回声区，提示局部有血栓形成，管腔内血流信号消失提示血管闭塞，见图1B。结果显示：去细胞光氧化组移植血管术后4周内均未发现血管闭塞，玻璃化深低温组2根血管在第4周时出现信号消失现象，提示血管完全闭塞。但两组血管中不同时段均可在血管管腔内发现局部的实性低回声区，提示局部有血栓形成，见图1B。术后1周血栓形成情况玻璃化深低温组和去细胞光氧化组分别为1/6、1/6，术后2周两组血栓形成情况分别为3/6、1/6，术后4周血栓形成情况分别为6/6、3/6，见表1。根据“确切概率法”用行×列表行字2检验，术后4周去细胞光氧化组累计通畅率高于玻璃化深低温组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.3 各组大体观察及HE染色光镜观察

所有移植血管样本的大体观察及HE染色显示，玻璃化深低温组术后1周移植血管搏动良好，颜色与自体血管一致，吻合口轻度粘连，HE染色显示血管内壁欠光滑；免疫反应表现比较严重，中层及外膜可见淋巴细胞浸润，第2周时，血管搏动可，颜色与自体血管基本一致，管壁变厚，管腔变窄；HE染色可见外膜中性粒细胞和淋巴细胞浸润，部分血管管腔内可见血栓形成。第4周时移植血管搏动不良，颜色变浅，较自体血管苍白，移植段血管增生肥厚。管腔狭窄或堵塞，中层弹力纤维排列不连续，松散，部分管腔几乎完全被血栓填充，见图2A。去细胞光氧化组术后1周移植血管搏动良好，颜色与自体血管一致，与周围组织无明显粘连，血管内壁光滑；同时血管内壁见散在内皮细胞生长，外膜见少许淋巴细胞浸润。第2周时，移植血管搏动良好，颜色与自体血管一致，与周围组织轻度粘连，血管内壁光滑，可见明显内皮细胞长入，血管管壁未见明显破坏及变性改变，管壁弹性纤维连续致密，外膜淋巴细胞浸润少。第4周时移植血管形态仍保持红润，与自体血管无明显差异，HE染色显示基本形成类似于正常血管壁的结构，管壁内弹性膜完整，弹性纤维连续性好，见图2B。

2.4 Ⅷ因子染色

去细胞结合光氧化组Ⅷ因子染色阳性，有内皮样细胞生长，见图3A箭头所示。而玻璃化深低温处理组Ⅷ因子染色提示内皮细胞有不同程度的破坏甚至未见内皮细胞，见图3B。

2.5 增生程度图象分析

观察弹力纤维染色玻片，使用图像分析系统计算内膜/中膜厚度比（I∶M）代表内膜增殖程度。通过比较可见，两组血管移植后1周I∶M比值差异无统计学意义（P>0.05）。术后2周，两组移植血管的I∶M比值均有所升高，玻璃化深低温组为（0.28±0.12），去细胞光氧化组为（0.23±0.11），差异有统计学意义（P<0.05）。术后4周，玻璃化深低温组I：M比值为（0.45±0.15），要显著高于去细胞光氧化组的（0.31±0.12），差异有统计学意义（P<0.05），见表2。玻璃化深低温组术后4周I∶M比值较术后2周有显著上升，而去细胞光氧化组移植血管的I∶M比值则上升的相对平稳。

3 讨论

随着外周血管手术技巧的逐步成熟，小口径（<6 mm）血管移植物的需求增长迅速。但由于术后早期急性血栓的形成、内皮化的不完全及和远期植入后的内膜增生，这些因素往往导致异体小血管的术后通畅率无法满足临床要求[6-7]。尽管植入后血栓事件是小口径人工血管长期低通畅率的主要限制因素，但迄今为止，去细胞化的天然组织仍是临床最广泛的使用方法[8]。脱细胞处理存在一定的争议，因为该过程的不完整可能导受体发生免疫原性反应，而过度的脱细胞处理又会导致移植桥血管机械性能的丧失及远期动脉瘤发生的可能[9-10]。笔者将脱细胞后的兔颈动脉通过光氧化交联固定，以期达到增强机械强度的目的，通过此次动物实验4周的观察，光氧化组术后无桥血管瘤样扩张的情况发生。而相比较之下，18例玻璃化深低温移植组的兔颈动脉中有3例移植血管发生了瘤样扩张，前期实验中我们曾证实去细胞过氧化处理的兔颈动脉热皱缩温度、抗张强度及最大拉伸距离要优于玻璃化深低温处理的兔颈动脉[4]，从此次实验中瘤样扩张的发生概率来看，也侧面证实了玻璃化深低温处理对异体小血管机械性能存在一定程度的影响。

低温保存技术是存储同种异体大血管移植物的有价值的技术[11-12]。但低温保存方法对移植物抗原性的影响一直存在争论，主要分歧在于该处理方式对同种异体移植物抗原性的影响，对此不少学者进行了多方面验证[13-15]。通过本次实验的HE染色观察，玻璃化深低温处理的异体小血管在移植后早期淋巴细胞浸润程度要明显于去细胞光氧化处理的异体小动脉，后期血管重构程度也明显不如去细胞光氧化组的异体小血管，血栓形成率更高（累及通畅率44.4% vs 72.2%）。提示玻璃化深低温保存方法仍保存了血管组织的部分抗原性，从而引起宿主动物的免疫排斥反应。而去细胞光氧化反应组的移植血管因为血管前期处理时去除了最主要的抗原性内皮细胞，所以术后移植血管结构基本正常，管壁炎性细胞浸润程度明显减轻，术后4周对该组血管行Ⅷ因子染色检测，均观察到内皮细胞生长良好且均匀分布，弹力纤维连续，并且在有些管道外壁还可见较多新生血管的形成，提示该组移植血管兼容程度较好。前期实验证实，去细胞光氧化是一个无细胞毒性的化学试剂参与过程，同时又保留了较完整的、无免疫排斥的血管基质[4]，因此内皮细胞更易于粘附生长，随着移植血管内皮化程度逐步完全，血栓形成率大幅下降。

术后内膜增生也是玻璃化深低温组异体小动脉的一个突出问题。通过比较术后两组的I∶M比值發现，术后1周两组移植血管的I∶M比无明显差异，而术后2周两组均有所上升，且上升程度有统计学差异（P<0.01），术后4周玻璃化深低温组兔颈动脉I∶M比值上升程度较为显著，而去细胞光氧化组的I∶M比值则相对平稳，提示去细胞光氧化组的近期效果优于玻璃化深低温组。进一步比较两组I∶M比值上升速率，提示去细胞光氧化组远期通畅率亦优于玻璃化深低温组。当然也有不足，因为从I∶M比值整体上升趋势来看，去细胞光氧化组移植血管同样也存在内膜增生的趋势。

本次实验证实，去细胞结合光氧化处理的异体兔颈动脉体内稳定性优于玻璃化深低温保存的异体兔颈动脉，移植后具有更高的远期通畅率。但同样也存在瘤样扩张，内膜增生等不足，提示我们在后续的实验中需要采取相应的针对性措施以改进。

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（收稿日期：2018-07-09）